Name: an efficient and high yield method for isolation of mouse dendritic cell subsets
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets at JoVE.com

연구는 에이즈 연구를위한 아인슈타인 암 센터 (NIH / NCI CA013330) 및 센터 (NIH / NIAID AI51519)에 의해 지원 FACS 코어 기능을 사용하여 수행 하였다 세포 계측법이 작품은 SAP 흐름에 NIH / NIAID 보조금 AI45889에 의해 지원되었다.

동물 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인 된 지침에 따라 수행됩니다. 불임을 필요로하는 모든 절차는 바이오 안전성 캐비닛에서 수행된다. 마우스의 B16.Flt3L 흑색 종의 1 주입 <ol><li> 배양 37 ° C에서 10 % CO 2 완전 DMEM 배지에서 0.5 × 106 세포 / ml의 밀도로 T25 조직 배양 플라스크에서 FLT-3 발현 B16 흑색 종 세포주. 세포가 도달 할 때까지 ~ 90 %의 ?...

<ol>
	<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology,+quantitation,+tissue+distribution.">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antigen+processing+by+dendritic+cell+subsets+in+vivo.">Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo.</a> Science. 315 (5808), 107-111 (2007).</li><li>Belz, G. T., Nutt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+programming+of+the+dendritic+cell+network.">Transcriptional programming of the dendritic cell network.</a> Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).</li><li>den Haan, J. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+versus+activation-dependent+cross-presentation+of+immune+complexes+by+CD8(+)+and+CD8(-)+dendritic+cells+in+vivo.">Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).</li><li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation:+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance.">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li><li>Yamazaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++CD205++splenic+dendritic+cells+are+specialized+to+induce+Foxp3++regulatory+T+cells.">CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells.</a> J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).</li><li>Mukherjee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+steady-state+dendritic+cells+induces+deletion+of+diabetogenic+CD8(+)+T+cells+independently+of+PD-1+and+PD-L1.">DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1.</a> Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).</li><li>Melief, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Regulation+of+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+by+dendritic+cells:+peaceful+coexistence+of+cross-priming+and+direct+priming.">Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming.</a> Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).</li><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).</li><li>Benlagha, K., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d-restricted+mouse+V+alpha+14+and+human+V+alpha+24+T+cells:+lymphocytes+of+innate+immunity.">CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity.</a> Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Arora, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+subset+of+dendritic+cells+controls+the+cytokine+bias+of+natural+killer+T+cell+responses+to+diverse+glycolipid+antigens.">A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens.</a> Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).</li><li>Semmling, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+cross-priming+through+CCL17-CCR4-mediated+attraction+of+CTLs+toward+NKT+cell-licensed+DCs.">Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs.</a> Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).</li><li>Duriancik, D. M., Hoag, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+enumeration+of+dendritic+cell+populations+from+individual+mouse+spleen+and+Peyer's+patches+using+flow+cytometric+analysis.">The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis.</a> Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).</li><li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3++lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3++dendritic+cells+in+vivo.">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).</li><li>Mach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+dendritic+cells+stimulated+in+vivo+by+tumors+engineered+to+secrete+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+Flt3-ligand.">Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand.</a> Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).</li><li>Vremec, D., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+purification+of+large+numbers+of+antigen+presenting+dendritic+cells+from+mouse+spleen.">The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen.</a> Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+1.9,+Removal+of+lymphoid+organs.">Unit 1.9, Removal of lymphoid organs.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3B,+Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li><li>Vremec, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+dendritic+cell+viability+in+culture.">Maintaining dendritic cell viability in culture.</a> Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).</li></ol>

수지상 세포는 T 세포 반응의 프라이밍 관련된 제시 세포 주요 전문 항원 것으로 받아 들여진다. 이들의 주요 기능은 T 세포에 프리젠 테이션을 위해 항원을 복용하고 처리하여 조직의 미세 환경을 조사하는 것입니다. 특정 DC 서브 세트의 기능을 연구하기 위해, 이들은 정상적인 표현형 및 기능을 유지하는 방식을 사용하여 충분한 수 격리 될 필요가있다. 대부분의 프로토콜은 순진 생쥐의 특정 DC...

은 &quot;큰 별 모양 (그리스어 덴 드론) 셀은&quot;림프 기관 (1)에서 발견 수지상 세포 (DC)는 거의 사십년 전에 발견되었다. 많은 연구 수지상 효과적으로 나이브 T 세포 (2)를 자극 할 수있는 유일한 항원 제시 세포 인 것으로 나타났다. 이러한 세포의 주요 기능은 항원 제시 분자 상에 흡수 및 항원 제시 및 효율적인 처리 및 이들의 로딩을합니다. 마우스 비장 DCS는 형질 종래의 서브 세트들로 분리 될 수있다. 형질 DC가이 중 CD11c의 낮은 표현과 B220 및 GR-1의 높은 수준을 특징으로한다. 또한 표면 마커 mPDCA1에 대한 긍정적 인 내가 수용체 9 (TLR9​​) 리간드와 같은 수신자에 대한 응답으로 인터페론 유형을 분비한다. 종래의 수지상 세포는 중 CD11c 및 MHC 클래스 II 표현 높다. 그들은 같은 CD4, CD8α, DEC205, CD 등의 표현형 마커의 표면 발현에 따라 세 가지 하위 집합으로 분할 할 수 있습니다(11B) 및합니다 (33D1 항체에 의해 인식 DCIR2) 수지상 세포 억제 수용체 2 단백질 3,4. CD8α 순위 DC가도 cDC1로 알려져 있습니다, 이러한 CD11b를하고 33D1 같은 골수 마커 DEC205 긍정적, 그러나 음. 또한 cDC2라는 CD8α NEG의 DC는, 33D1, CD11b를하고 CD4 양성하지만 DEC205이 부족하다. 이중 음의 부분 집합 (CD4 및 CD8α 모두 즉, 부정적)은 비교적 드문이며, DEC205 및 33D1에 대한 부정적이다. 그것은 최소한의 특성화 된 부분 집합이며 CD8α NEG DC의 덜 차별화 된 형태 일 수있다. 다양한 DC 부분 집합의 표현형 차이는 또한 생체 내 기능을 확장 할 수 있습니다. CD8α NEG DC가 매우 식세포하고 주로 CD4 T 세포 3 MHC 클래스 II를 통해 외래 항원을 제시하는 것으로 생각된다. 반대로 CD8α 순위 수지상은 MHC 클래스 I에 가용성 단백질 항원 제시를위한 전문화메커니즘의 크로스 발표했다. 크로스 프레젠테이션의 결과는 이러한 수지상 (5)의 작동 상태에 따라 달라지며, 세포 독성 T 세포 (CTL을) 또는 조절 T 세포를 6 2,7- 개발 확장을 초래할 수 있습니다. 감염된 세포 사멸 세포로부터 유래 된 항원 제시 강한 CTL 응답 (9)을 유도하는 반면, 주로 T 세포 (8)의 삭제에 방지 DEC205 항체 매개 배달 결과를 사용하여 CD8α 순위 수지상 세포에 항원의 타겟팅. 펩타이드 항원의 인식에 더하여, 상기 포유 동물의 면역 시스템은 지질 및 당지질 항원을 인식하도록 진화했다. 이 항원은 다양한 포유 동물에서 여러 관련 형태로 존재하는 MHC 클래스 I-같은 세포 표면 단백질 CD1 분자에 의해 제공됩니다. 쥐에 CD1d이라는 고도의 보존 CD1 분자의 단일 유형은 당지질 항원 (10)에 대한 책임이다. 주요<html> CD1d / 당지질 복합체를 인식하는 T 세포 집단이 불변 NKT 세포 (하여 iNKT 세포)라고한다. 이들 세포는 11 다양성이 제한된 TCRβ 쇄와 결합하는 불변 사슬 TCRα 이루어지는 반 불변 T 세포 수용체 (TCR)를 표현한다. 증식 및 활성화 효과기 T 세포가 분화 할 필요가 종래의 T 세포를 달리하여 iNKT 세포 이펙터 집단으로 존재 당지질 12 투여 후 신속하게 응답을 시작한다. 생리 학적으로 중요한 지질 항원 제시 세포의 확인은 연구의 활성 영역이며, 이러한 B 세포, 대 식세포 및 수지상 세포와 같은 여러 독특한 세포 유형이이 기능을 수행하기 위해 제안되었다. 그러나, 수지상의 CD8α 순위 서브 세트 마우스 인 iNKT 세포 (13) 및 CD8 T 세포 14 당지질 매개로 프라이밍 간 지질 흡수 및 항원 제시를 매개하는 주요 세포 인 것으로 입증되었다. 다른 항원 제시 세포에 의해 항원 제시의 효율성을 비교하기 위해 &quot;&gt; ​​ove_content, 간단한 접근 방식은 이러한 종류의 세포 전달 실험 종종 면역 시험 수행된다 나이브 호스트로 항원 당량으로 펄싱. 정제 된 장갑차의 종류를 전달하는 것이다. 이러한 세포들은 전체 셀 (15)의 2 % 미만을 구성하는 림프 기관에서 희귀 집단이 존재하기 때문에, 생체의 항원 처리 된 수지상 세포로 전달 연구를 수행하는 것은 어려운 것이다. 이는 공여 동물에서 이들 세포의 발달을 향상시킬 필요가있다 분리 프로토콜의 효율을 증가시키기 위해. 이는 알려져있다 PDC, CD8 순위 및 CD8 NEG DC 서브 세트 명시 FMS 관련된 수용체 티로신 키나아제 3 (FLT-3)의 생성에 필요한 공통 림프 및 골수 조상 공통. 생체 FLT-3 리간드시 (FLT-3L) 관리, emigratFLT-3 골수 전구 세포를 발현 이온 말초 림프 기관의 증가 된 시드 및 성숙 DC 자손 (16)의 팽창의 결과로 증가된다. FLT-3의 발현은 B, T 또는 NK 세포 분화 경로에 헌신하는 동안 손실됩니다. 따라서, 최소한의 변경은 FLT-3L의 투여시 이들 세포에서 관찰된다. DC 집단에 비슷한 확장 FLT-3L (17, 18)의 지속적인 전신 수준을 제공하기위한 간단하고 경제적 인 방법을 제공한다 뮤린 FLT-3L를 분비 B16 흑색 종 세포주의 주입에 의해 생성 된 종양을 갖는 마우스에서 관찰된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 따라서 크게 후속 실험에서 분리 될 수있는 이러한 세포의 수율을 증가시킨다 마우스 비장 모두 정상적인 DC 서브 세트의 확장을 자극하기 위해 FLT-3L 분비 B16 흑색 종 세포의 이식에 기초하는 프로토콜을 개발 . 십사일 피하 메신저 다음 - 우리는 일관되게 (10) 내에 발견총 비장 세포의 60 % - FLT-3 분비 종양의 농장은, 마우스 (40)를 구성하는 수지상 세포의 현저한 농축과 비장 비대 개발한다. 이 비장에서 다른 DC의 부분 집합은 고순도의 표준을 일부 특정 표현형 마커를 사용 시중에서 판매하는 세포 정제 키트를 이용하여 분리 할 수​​있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (dry powder)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9-6705-004-220</td>
			<td>Used to prepare 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11130-051&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>20012-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue (dry powder)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6146-5G&#160;</td>
			<td>Prepare 0.08% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-152-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;Pos mouse DC isolation kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c-FITC&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8&#945;-PerCP&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220-PE&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>26048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G1 needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri plates&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand MACS separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore 200 &#956;l pipette tips&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>111623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning ultra-low attachment 96-well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Jackson Research Laboratories, Jax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine B16.Flt3L melanoma cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described by Mach et al. ,2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free DMEM and RPMI media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 
			 
			5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml HEPES Buffer (1 M)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml L-glutamine (200 mM)&#160; 
			 
			0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.&#160; Filter sterilize the media by passing through a 0.22 &#181;m vacuum filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete RPMI and DMEM media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Collagenase D and DNase 1 stock solution 
			Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 Units of collagenase activity per ml 
			 
			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 &#176;C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and high yield method for isolation of mouse dendritic cell subsets

수지상 세포 (DC가)를 취득 처리 및 T 세포 성 면역을 시작하는 분자를 제시 항원에 항원을 제시하는 주된 책임 전문 항원 제시 세포이다. 수지상 세포는 여러 표현형 기능적 이종 서브 세트들로 분리 될 수있다. 비장 수지상 세포의 세 가지 중요한 부분 집합은 CD8α 순위 및 CD8α NEG 세포 형질 있습니다. 형질 DC가 내가 인터페론 유형의 자연 생산자 및 항 바이러스 T 세포 면역에 중요하다. CD8α NEG DC의 부분 집합은 MHC 클래스 II 항원 제시를위한 전문 중앙 CD4 T 세포를 프라이밍에 참여하고있다. CD8α 순위 수지상 세포는 외래 항원과 CD8 T 세포 프라이밍의 크로스 프리젠 테이션 주로 책임이 있습니다. CD8α 순위 수지상는 전문 T의 CEL에 CD1d 분자에 의해 당지질 항원의 프레 젠 테이션에서 가장 효율적인 것으로 입증되었다불변 자연 살해 T (하여 iNKT) 세포로 알려진 리터 인구. FLT-3 리간드의 관리는 궁극적으로 쥐 모델에서 말초 림프 기관에 수지상 세포의 확장의 결과로, 골수에서 수지상 세포의 전구 세포의 이동의 빈도를 증가시킨다. 우리는 다른 DC 서브 세트의 생체 내 능력을 비교하는 셀 이전 실험에서 사용하기 위해 기능 수지상 세포 다수의 정제이 모델을 채택하고있다.

이 절차의 결과는 주입 된 흑색 종 세포에서 발현 뮤린 FLT-3L 의해 DC 서브 세트의 확장에 의존하고있다. B16.Flt3L 종양은 C57BL / 6 마​​우스에서 유래하고, 거부로 인해 설립 될 수있는 종양의 실패를 방지하기 위해 그 변형 배경으로 동물에 이식한다. 경우에 따라서는 경로 또는 관심 수용체 시그널링에 공지 결함 수지상 세포를 유도 유전자 변형 마우스를 사용하는 것이 ?...

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An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...