Name: preparation of acute brain slices using an optimized n-methyl-d-glucamine protective recovery method
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method at JoVE.com

Detta arbete finansierades av Allen Institute for Brain Science. Författarna vill tacka Allen Institute grundarna Paul G. Allen och Jody Allen, för deras vision, uppmuntran och stöd. Vi tackar också Allen Institute teknisk supportpersonal för att utföra Djurvård, djurskötsel och genotypning.

Förfaranden som inbegriper transgena möss har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Allen Institute for Brain Science. Både manliga och kvinnliga C57BL/6 möss (viktintervall 10-30 g) användes i dessa experiment. Några av de representativa resultat beskriver data samlas in från levande mänskliga hjärnan skivor. Hjärnbarkens vävnadsprover erhölls under neurosurgeries för borttagning av tumören. Det var nödvändigt att ta bort den överliggande hjärnbarkens vävnaden för att få tillgång till den sjuka vävnaden. Patientens informerade samtycke erhölls i alla fall för användning av Neurokirurgiska vävnad för forskningsändamål enligt ett protokoll som godkänts av den institutionella Granskningsnämnden för Swedish Medical Center.
1. beredning av Media och reagenser (tabell 1)
Obs: Lösningar bör göras i renat vatten som är fritt från spårmetaller och andra orenheter. Det rekommenderas att lösningar göras färsk på dagen för experimentet, även om oanvända lösningar kan lagras vid 4 ° C i upp till 1 vecka, om så önskas. 1 L av varje formulering ovan räcker för 1 – 2 skivning förfaranden. Alla aCSF lösningar måste vara mättad med carbogen (95% O2/5% CO2) före användning för att säkerställa stabila pH buffert och adekvat syresättning. PH-värdet i alla lösningar bör anpassas till 7,3-7,4 och osmolalitet mätt och justeras till 300-310 mOsmol/kg.
<ol><li>Förbereda NMDG-HEPES aCSF (i mM): 92 NMDG, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukos, 2 tiourea, 5 Na-askorbat, 3 Na-pyruvat, 0,5 CaCl2·2H2O och 10 MgSO4·7H2O. Titrate pH till 7,3 –7.4 med 17 mL +/-0,5 mL 5 M saltsyra. Obs: Detta titrering steg bör helst utföras före tillsats av divalenta katjoner att undvika utfällning; nederbörden kan dock återföras vid justering av pH till fysiologiska intervallet.</li>
	<li>Förbereda HEPES holding aCSF (i mM): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukos, 2 tiourea, 5 Na-askorbat, 3 Na-pyruvat och 2 CaCl2·2H2O 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH till 7,3 – 7,4 med flera droppar koncentrerad 10 N NaOH.</li>
	<li>Förbereda inspelning aCSF (i mM): 124 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12,5 glukos, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O och 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH till 7,3-7.4 med några droppar koncentrerad 10 N NaOH.</li>
	<li>Förbereda Na+ spike-in-lösning (2 M): 580 mg NaCl löses i 5 mL av nylagade NMDG-HEPES aCSF. Detta är tillräckligt lösning för en hjärna slice prep.</li>
	<li>Förbered 2% agaros som ska användas för inbäddning av vävnad. Lös upp 2 g av agaros typ 1B (se Tabell för material) i 100 mL 1 x PBS och mikrovågsugn tills bara kokande. Snurra för att blanda, därefter Häll blandningen i en steril 10 cm petriskålar och låt stelna. Lagra agaros plattan i en förseglad plastpåse vid 4 ° C fram till användning.</li>
	<li>Förbereda injicerbart anestetikum arbetar stamlösning. Blanda 2,5 g 2,2,2-Tribromoethanol med 5 mL 2-metyl-2-butanol och lös sedan gradvis i 200 mL PBS, pH 7,0 – 7,3. Filtrera stamlösning med 0,22 µm filter före användning och förvaras vid 4 ° C skyddas från ljus. Obs: Kontakta respektive användning av djur kommittén riktlinjer och regler för att bestämma förfallodatum och bortskaffande förfarandet för det bedövningsmedel som arbetar stamlösning.</li>
</ol>2. inställning av skivning Station
<ol><li>Ställa in skivning stationen med slicer mjukpappersmaskinen och kirurgiska instrument (se Tabell för material). Att kalibrera slicer maskinen, bifoga en zirkonium keramiska injektor blad till blad armen med snabb-självhäftande lim, sedan infoga preparathållaren och justera den ledande kanten på bladet till preparatet innehavaren rim lämnar en liten lucka för att se till bladet inte skrapar metallen. Obs: Om bladet kanten inte är fysiskt skadat det kan återanvändas för många veckor eller månader utan ersättning. Olika vävnad slicer modeller är kommersiellt tillgängliga, av vilka många kan ge utmärkt prestanda när optimalt kalibrerade. Det ideala instrumentet bör ha minimal z-axeln böjning, antingen direkt mätt och trimmad eller empiriskt observerat.</li>
	<li>Ställa in en 250 mL bägare fylld med 200 mL NMDG-HEPES aCSF och före chill på is med konstant carbogenation (tillämpas via en gas diffusor sten nedsänkt i media) för > 10 min. Obs: Denna lösning kommer att användas för transcardial perfusion och för att fylla reservoaren skivning maskin vid snittning.</li>
	<li>Ställ in inledande hjärnan slice återhämtning kammare fylld med 150 mL NMDG-HEPES aCSF (upprätthålla konstant carbogenation) och placera kammaren i uppvärmda vattenbad hålls 32 – 34 ° C. Obs: En slice kammare efter design av Edwards och Konnerth (1992)52 rekommenderas för det här steget. Dessa kammare kan göras med lätt tillgängliga laboratorium objekt (250 mL-bägare, nylon mesh-nät, 50 mL koniska tube, 35 mm plast rund maträtt). Var noga med att säkerställa att segmentet nettning återstår gratis luft bubblor, särskilt sådana som produceras kontinuerligt av carbogen gas bubbla stenarna som dessa kan orsaka skivor att flyta upp och bli skadade. Nettning bör vara nedsänkt ungefär 1 cm under vätskeytan.</li>
	<li>Ställa in ett hjärnan segment håller kammaren. en design med flera oberoende brunnar i en större behållare rekommenderas (se Tabell för material). Fyll behållaren med 450 mL av HEPES aCSF och varm rumstemperatur under konstant carbogenation fram till användning. Obs: Hjärnan skivor kommer att överföras från inledande återhämtning kammaren till kammaren för långsiktig lagring innan elektrofysiologiska inspelning. Var noga med att säkerställa att de slice nettning är fri från luftbubblor alltid.</li>
	<li>Förbereda smält agarosgelelektrofores för inbäddning av vävnad. Använd den öppna änden av en 50 mL konisk injektionsflaska som en cookie cutter för att skära ut ett block med 2% agaros från tidigare beredda skålen. Löst mössa koniska injektionsflaskan, då mikrovågsugn för 10 – 30 s tills Agarens bara smält. Inte överhettas.</li>
	<li>Häll den smälta agarosen i 1,5 mL rör. Upprätthålla Agarens i smält tillstånd att använda en thermomixer inställd på 42 ° C med kraftig skakning. Se noga till att smält Agarens inte stelna förtidigt.</li>
	<li>Placera tillbehöret kylning block för utsnittet på is svalna före vid denna tid.</li>
</ol>3. Transcardial Perfusion
Obs: Transcardial perfusion förfarandet är ett viktigt steg när du arbetar med vuxna djur och är viktigt att uppnå snabb kylning av hjärnan och långsammare metabolism via hjärnan infusion av låg Na+, låg Ca2 +/ hög Mg2 + aCSF lösning. Transcardial perfusionen tjänar också till att rensa röda blodkroppar från hjärnan kärlsystemet, vilket minskar autofluorescens som kan störa visualisering och inriktning av fluorescently märkt cellpopulationer i transgena linjerna. Det är inte tillrådligt att utelämna transcardial perfusion.
<ol><li>Djupt söva möss av intraperitoneal injektion av bedövningsmedel arbetande stamlösning (250 mg / kg: 0,2 mL 1,25% bedövningsmedel arbetar stamlösning per 10 g kroppsvikt, se Tabell för material). Efter ~ 2 – 3 min, verifierar tillräckligt djup anestesi genom att bedöma tå nypa reflex. Om så krävs, injicera en ytterligare volym av bedövningsmedel fungerande lager och ompröva tå nypa reflex efter en annan 2-3 min.</li>
	<li>Fyll en 30 mL spruta med 25 mL av carbogenated NMDG-HEPES aCSF från pre kylda 250 mL bägaren (2 – 4 ° C är optimalt, i motsats till slaskiga eller fryst lösning). Bifoga en 25 5/8 gauge nål.</li>
	<li>Med musen på ryggen, fästa ned framtassarna och hind tassar för stabilitet. En 15 cm glas petriskål fylld med härdad silikon fungerar väl som bas.</li>
	<li>Med en skalpell, göra en laterala snitt öppna brösthålan på nivån av membranet. Använd fina sax för att klippa genom bröstkorgen på antingen sida ta hand att undvika klippning hjärta och lungor.</li>
	<li>Fästa tillbaka mitt del av bröstkorgen att exponera hjärtat. Stick in nålen i 30 mL sprutan i vänster kammare och skär höger förmak med fina sax att låta blod att avsluta hjärtat.</li>
	<li>Tryck in sprutkolven använder manuell konstant tryck och BEGJUTA djuret med den kylda NMDG-HEPES aCSF med en hastighet på ~ 10 mL/min. Obs: Om perfusionen lyckas kan levern kommer att förändras i färg från djupröd till svagt gul och i vissa fall klara vätskor kan observeras spännande näsborrarna mot slutet av förfarandet.</li>
</ol>4. hjärnan dissektion och skivning
<ol><li>Halshugga djuret. Använd en skalpell för att öppna huden på huvudet och exponera kalott.</li>
	<li>Använd Super finskuren sax att klippa bort huden över kalott och göra små snitt sido på vardera sidan på den kaudala/ventrala basen av skallen. Göra ytterligare grunt nedskärningar börjar vid den kaudala/dorsala aspekten av skallen i rostralt riktning upp dorsala mittlinjen utan för att skada underliggande hjärnan. Göra en slutlig 'T' skära vinkelrätt till mittlinjen på nivån av luktsinnet lökar. Obs: Var noga att se till att ingen skada sker till hjärnan regionerna av intresse. I synnerhet inte vid något tillfälle bör det finnas någon tryckkraft som tillämpas på hjärnan själv.</li>
	<li>Använda runda-tip tången och förstå skallen börjar vid den rostralt-mediala aspekten som du kan skala tillbaka mot den caudal-lateral riktningen. Upprepa för båda sidor att spricka öppna och ta bort de dorsala halvorna av skalle locket att exponera hjärnan. Gröp försiktigt ur intakt hjärnan i bägaren av pre kylda NMDG-HEPES aCSF. Låt hjärnan svalna jämnt för ~ 1 min.</li>
	<li>Använd stora spateln för att lyfta hjärnan ur bägaren och på petriskål täckt med filterpapper. Trim och blockera hjärnan enligt rekommenderad vinkel skivning och önskas hjärnregionen sevärdheter. Arbeta snabbt för att undvika långvarig syrebrist under hantering. Obs: Många skivning vinklarna är möjligt. Den exakta blockerande metod och skivning vinkeln beror på den exakta hjärnregionen celltyp och krets att studeras.</li>
	<li>Anbringa hjärnan blocket att preparathållaren använda klister. Dra tillbaka den inre bit av preparathållaren nog att dra tillbaka hjärnan blocket helt inuti. Häll den smälta agarosen direkt i hållaren tills hjärnan blocket är helt täckt av agaros. Klämma den nedkylda tillbehör kylning block runt preparathållaren för ~ 10 s tills agarosen stelnat.</li>
	<li>Sätt in preparathållaren i kärlet på utsnittet maskinen och kontrollera korrekt anpassning. Fyll behållaren med kvarvarande pre kylda, syresatt NMDG-HEPES aCSF från 250 mL bägaren och flytta en bubbla sten i behållaren för varaktigheten av skivning för att säkerställa adekvat syresättning.</li>
	<li>Justera Mikrometern börja avancera agaros-embedded hjärnan preparatet. Starta utsnittet och empiriskt justera advance hastighet och svängningen frekvens till önskad nivå. Obs: Båda inställningarna bör vara i det lägre intervallet. För bästa resultat passera en enda av bladet armen bör ta cirka 20 s och svängningen bör producera mycket smidig och skonsam brummande med ingen overt surrande.</li>
	<li>Fortsätta framåt och skivning vävnaden i steg om 300 µm (eller annan önskad tjocklek) tills hjärnregionen sevärdheter är fullt sektioneras; den totala tiden för skivning förfarandet bör vara mindre än 15 min.</li>
</ol>5. optimerad NMDG skyddande indrivningsförfarandet
<ol><li>NMDG återhämtning initsteget (kritiska steg): efter avslutad snittningen förfarandet, samla upp alla skivor med hjälp av en cut-off plast Pasteur röret t och överföra dem till en pre värmde (34 ° C) inledande återhämtning kammare fylld med 150 mL NMDG-HEPES aCSF. Överföra alla skivor i kort följd och starta en timer så snart alla skivor flyttas in i recovery-kammaren.</li>
	<li>Se tabell 2 för att fastställa optimala Na+ spike-i schemat enligt mus ålder. Obs: Detta förfarande är en praktisk metod för att uppnå en kontrollerad återinförandet av Na+ in i hjärnan slice kammaren och är optimerad för en specifik hjärnan slice kammare geometri och reservoar volym och typ (se Tabell för material).</li>
	<li>Utföra stegvis Na+ spike-i förfarandet genom att lägga till de angivna volymerna av Na+ -spike-in-lösning på den angivna tider. Lägg till Na+ spike-i lösningen direkt i bubbelflaskan skorstenen av inledande återhämtning kammaren att underlätta snabba blandning.</li>
	<li>Överföra alla skivor till HEPES aCSF långsiktiga innehav kammaren hålls vid rumstemperatur. Tillåta skivor att återvinna för en ytterligare 1 h i den HEPES håller kammaren innan patch clamp inspelning experiment.</li>
</ol>6. Patch Clamp inspelning
Obs: Följande grundläggande procedurer endast ge några praktiska överväganden och är inte avsedda att representera detaljerade protokoll för patch-clamp inspelningar, eftersom dessa kan hittas någon annanstans53,54. En patch clamp elektrofysiologi rigg krävs för denna ansökan. Detta kommer vanligtvis att bestå av ett upprätt Mikroskop utrustad med infraröd differentiell störningar kontrast (IR-DIC) optik och ett fluorescens belysning system, en patch clamp förstärkare och data digitizer, motoriserade micromanipulator och Mikroskop plattform, vibrationer isolering tabell, Faradays bur och lösning värme och perfusion system. Den provkammare och plattformen bör utformas för nedsänkt skiva inspelning. För flera neuron patch clamp inspelningar krävs en rigg utrustad med flera förstärkare, huvudet stadier och hög kvalitet micromanipulators. Dessutom, för bästa resultat, en rigg utrustad med ett 900 nm IR band pass filter och matchande optiska komponenter rekommenderas att säkerställa adekvat visualisering av celler ligger > 50 µm djupt i hjärnan skivor. Korrekt anpassning för Kӧhler belysning är också viktigt för tydlig visualisering.
<ol><li>Förbereda intracellulära pipett lösning (i mM): 130 K-glukonat, 4 10 HEPES, 0.3 EGTA, KCl, 10 phosphocreatine-Na2, 4 MgATP, 0.3 Na2-GTP, och 13,4 biocytin. Justera pH till 7,35 med 1 M KOH och osmolalitet till 285 – 290 mOsmol/kg använder sackaros som behövs.</li>
	<li>Förbereda patch clamp elektroder från tjockväggiga borosilikatglas kapillärer; den idealiska patch clamp elektroden har en relativt korta och knubbiga Kona med en ~ 3 – 6 MOhm fylld tip motstånd i badet.</li>
	<li>Säkerställa att silverelektroden kablarna är ordentligt chlorided för att säkerställa stabila inspelningar. Göra detta (typisk) genom att dränka sist 3-4 mm av silver tråd i flytande blekmedel i ca 30 min eller tills tråden blir svart.</li>
	<li>Upprätta lösning perfusion med en peristaltiska pumpen inställt på 3 – 4 mL/min. Circulate carbogenated inspelning aCSF genom inspelning kammaren ta hand för att matcha inflöde och utflöde för att undvika spill.</li>
	<li>Överföra en enda hjärnan skiva in i kammaren med nedsänkning i inspelning och säkra på plats med en U-formad skiva ankare med nylon cross strängar. Identifiera mål hjärnregionen med ett 4 X air mål innan du byter till en högre makt mål (t.ex., hög numeriska bländaröppningen 40 X eller 60 X vatten nedsänkning mål).</li>
	<li>Visuellt identifiera en hälsosam målcellen. Utseendet på den neuronala membranen på soma, används som visualiseras med hjälp av IR-DIC mikroskopi, för att bedöma lämpligheten hos en kandidat cell för patch clamp inspelning. Obs: Friska nervceller normalt uppvisar följande funktioner: varken krympta eller svullna somata, mjuk kontrast av membran kanter och släta membran utseende. Dessutom majoriteten av friska celler finns > 30 µm djupt i segmentet, som ytliga nervceller kan skadas med avhuggna dendritiska processer. Nervceller som uppvisar ett plisserat utseende, klart synliga kärnor eller 'stekt ägg' utseende eller mycket mörka eller hög kontrast membran kanter bör undvikas.</li>
	<li>Back-fylla plåstret pipett med ~ 5 µL av intracellulära lösning och lasta det på elektrodhållare. Flyttar pipetten till inspelning badet ovan hjärnan slice och applicera lätt positiv tryck att rensa några hinder i spetsen. Noll pipett offset och övervaka tip motståndet med en membran test funktionen.</li>
	<li>Flytta pipettspetsen i kontakt med målet neuron's cell kropp; en liten grop bör bilda på membran ytan på grund av lätt positivt tryck.</li>
	<li>Så snart en membran dimple observeras, snabbt ta bort realiteten pressar och tillämpa skonsam sugkraft för att underlätta förseglar bildandet. När pipetten motståndet ökar till > 100 MOhm, aktiverar en anläggning-kommando till en nivå som motsvarar den förvänta vilande membranet potential för den rikta celltypen (-70 mV är en bra utgångspunkt).</li>
	<li>När tip motståndet når ≥1 gigaohm, försök bryta in i cellen genom att sprängas sönder membranet under patch pipetten med korta anfall av kraftig sug; funktionen 'zap' kan utnyttjas för att underlätta inkörning som behövs. Obs: En anläggning potential -70 mV föreslås för spänningen klämman experiment på kortikala neuroner. Friska nervceller kommer att ha en läcka nuvarande ingen mer negativ än-100 pA för varaktigheten av experimentet, men detta är delvis beroende på celltyp. En neuron skulle uteslutas från analys om vilande membranpotentialen var mer Aricebo än -50 mV, eller om tillgång motståndet ändras med mer än 20%.</li>
	<li>
När en stabil hela-cell patch clamp inspelning erhålls, rikta ytterligare neuroner för inspelning genom att upprepa steg 6,6 – 6.10. Var noga med för att undvika mekaniska störningar som skulle resultera i att förlora den första inspelningen.
	<ol>
<li>Välj ytterligare nervceller inom 100 µm första neuron att säkerställa en rimlig sannolikhet för att hitta synaptically-kopplade nervceller. Obs: Det kan vara bra i vissa fall att identifiera flera kandidat nervceller i framsätet och att pre-load och vald position alla pipetter i närheten till olika riktade celler innan den första patch clamp inspelningen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Författarna har något att avslöja.

Na + Spike-i förbättrar Gigaohm förseglar bildandet och Patch Clamp inspelning framgång Den första versionen av metoden NMDG skyddande återhämtning utformades specifikt för vuxen och åldrande djur2,5. Vissa tidiga användare har också försökt att tillämpa denna metod på juvenila djur hjärnan skivning (dvs, möss < 30 dagar gammal). Det har dock noterats att i motsats till utestående visuellt-bekräftade neuronala bevarandet med metoden NMDG skyddande återhämtning i detta åldersintervall, gigaohm förseglar bildandet kan ofta stall ut, vilket leder till misslyckade patch clamp inspelning försök. En hypotes är att NMDG kationer lättare fastnar i juvenil hjärnan skivor i förhållande till vuxna hjärnan skivor och kan hindra förseglar bildandet; dock gigaohm tätningar kan lätt bilda medan juvenil hjärnan skivor är helt nedsänkt i NMDG aCSF (inga data anges), vilket indikerar att NMDG aCSF i sig hindrar inte gigaohm förseglar bildandet.
Den snabba övergången från låg till hög Na+ lösning vid slutförandet av det inledande hjärnan slice återhämtning steget orsakar skador på neuronala membran och perturbs förseglar bildandet processen. Detta är intuitiv eftersom övergången från låg till hög Na+, kall-till-varm temperatur och dramatisk höjning av de Ca2 + Mg2 + förhållande till kollektivt leda till en massiv återkomsten av spontana synaptisk aktivitet. Denna hämmande rebound fas i hjärnan skivning förfarandet sannolikt att spegla reperfusionsskada efter en ischemisk förolämpning. Därmed ytterligare mildra neuronala membran skador i inledande återhämtningsfasen en gradvis Na+ spike-i förfarandet har införlivats som höjden av Na+ koncentration i NMDG skyddande återhämtning inkubation kammaren är långsamt och reproducibly förhöjda med exakt timing. Liksom i den ursprungliga skyddande indrivningsförfarandet är temporal dissociationen av Na+ höjd från temperatur och Ca2 +/Mg2 + baserat höjd fördelaktigt. Men dessutom Na+ spike-i förfarandet leder till små stegvisa ökningar extracellulära Na+ koncentration över tidiga tidpunkter och stora ökningar mot slutet tidpunkter, därmed ger hjärnvävnaden en möjlighet att bättre tillgodose till de stigande nivåerna som Na+ . Detta förfarande är ett alternativ till gradvis lösning exchange kontrolleras av en perfusion pump eller gravity dropp linjer som leder till ständiga ökningar i Na+ nivåer och kräver uppmärksamhet på både in- och utflöde till undvika överflöde av slice kammaren. Noterbart i denna Na+ stiger spike-i förfarandet osmolalitet av lösningen i slice kammaren gradvis under flera minuter innan skivor returneras till normal osmolalitet lösning, men detta påverkade inte negativt slice hälsa eller patch clamp inspelning framgång. En hög osmolalitet skärande lösning har tidigare använts för mellanhjärnan slice preparat för att bättre bevara dopaminneuron för patch clamp inspelningar57,58, vilket visar att detta tillfälliga hyperosmolality kan vara fördelaktigt i vissa sammanhang.
Genom att implementera en optimerad förfarande att kombinera NMDG skyddande återställningsmetod och gradvis Na+ utökats spike-i steg nyttan av hjärnan slice metoden för att täcka juvenil genom mogna vuxna djur åldrar. Detta uppdaterade protokoll är nu lämplig för ett brett utbud av djur åldrar använder en enda optimal NMDG aCSF formulering och förfarande. Om det behövs, Na+ spike-i förfarandet kan tillämpas med ett successivt längre dröjsmål eller långsammare tid kursen att förbättra lönsamheten för hjärnan skivor från äldre djur och vi har gett en grundläggande guide Rekommenderad spike-i scheman enligt till djur ålder (se tabell 2). Medan vi har gett en grundläggande ram som är lämplig för ett brett spektrum av applikationer, kan ytterligare avancerade steg utforskas för att ytterligare förbättra lönsamhet och livslängd av hjärnan skivor från vuxna och åldrande djur. Exempelvis strategier för återställande av glutation är särskilt effektiv i detta avseende och kan genomföras som beskrivs på andra ställen2,6.
Att förbättra genomströmning för utmanande experiment Analysen av synaptic anslutning av patch clamp inspelning är ett krävande program som kräver utmärkt konservering av både neuronala struktur och funktion för att uppnå en hög tillförlitlighet av framgång. Som antalet neuroner registreras samtidigt går upp linjärt, teknisk svårighetsgrad går upp supra-linjärt. Det finns många felmoder, och en av de vanligaste orsakerna till misslyckanden är oförmågan att formuläret adekvat gigaohm tätningar på en eller flera av de rikta cellerna. Detta kan dramatiskt långsamma framsteg, särskilt när tre eller fler nervceller måste registreras samtidigt. Överensstämmer med konstaterandet av snabbare gigaohm försegla bildandet tid med den optimera NMDG skyddande återvinning metoden, det var en markant förbättring i framgång och genomströmning av flera neuron patch clamp inspelning experiment med båda vuxen transgena mus hjärnan skivor och vuxna människohjärnan Neurokirurgiska skivor. Förbättrad effektivitet är nästan säkert kan tillskrivas både snabb och pålitlig gigaohm förseglar bildandet och förbättrad neuronala bevarandet av skivor med detta protokoll. Även om detta protokoll fokuserar på fördelarna uttryckligen för patch-clamp inspelning program, förväntas liknande vinster för andra utmanande experimentella tillämpningar där hjärnan slice lönsamhet är avgörande.

Akut hjärnskada slice beredningen är en grundläggande experimentellt modellsystem i neurovetenskap. För ungefär hälften av ett sekel, har denna plattform aktiverad dynamiska funktionella studier av hjärnan levande över en mängd olika anatomiska hjärnregioner och djurarter. Om den avsedda användningen är biokemi, funktionell avbildning, morfologi eller elektrofysiologi, är det av yttersta vikt att säkerställa optimal integritet och lönsamhet av skivad vävnad. Det är anledningen till att mycket flexibel juvenil gnagare hjärnan slice beredning (dvs.yngre än postnatal dag 30 för möss) har varit de mest föredragna hittills. Svårigheten att erhålla tillräckligt frisk hjärna skivor från mogna vuxna och åldrande djur har visat sig vara en stor utmaning för de flesta och har infört stränga begränsningar för att studera hjärnans mogna funktionella arkitektur. Detta är särskilt sant för patch clamp inspelning, en teknik som kräver utmärkta morfologiska och funktionella bevarande och är oumbärlig för att karaktärisera detaljerade inneboende och synaptic egenskaper av identifierade enda nervceller. För de senaste decennierna, den stora majoriteten av patch clamp Elektrofysiologer har förlitat sig på en ”skyddande skära' metod där sackaros-substituerade låg Na+ aCSF1 för att förbereda friska hjärnan skivor från juvenil, och i långt mindre utsträckning, unga vuxna djur. Denna metod bygger på förutsättningen att passiv Na+ tillströmning och efterföljande vatten inresa och cell svullnad under slice styckning steg är den dominerande förolämpning som leder till dålig överlevnad av nervceller, särskilt för de nervcellerna som ligger i den ytliga lager som är mest sannolikt att upprätthålla direkt trauma från bladet rörelsen. Men lämnar metoden skyddande skärande fortfarande mycket att önska för hjärnan slice förberedelse från mogna vuxna djur oavsett särskilt aCSF utformningen genomförs.
En enkel men effektiv lösning på problemet har varit beskrivs2,3,4,5,6 och kallas metoden 'skyddande återhämtning' hjärna slice. Den ursprungliga versionen av denna metod använder en NMDG-substituerade aCSF, som NMDG identifierades som den mest mångsidiga och effektiva bland olika andra kandidat natrium ion substitut (inklusive sackaros, glycerol, kolin och Tris). Media formuleringen var ytterligare förbättras genom tillägg av HEPES att motstå hjärnan slice ödem och ge starkare pH buffert7, samt tillägg av tillskott för att motverka de skadliga effekterna av oxidativ stress (tabell 1). Det bestämdes empiriskt att en inledande återhämtning inkubation steg i låg Na+, låg Ca2 +, och hög Mg2 + NMDG aCSF omedelbart efter vuxna hjärnan vävnad skivning var både nödvändig och tillräcklig för bättre neuronala bevarande över ett brett spektrum av områden i hjärnan, celltyper och djur åldrar3,5,6.
Särskilt, kan tidigare inkarnationer av vad nu dubbas de skyddande återställningsmetoden hittas i litteraturen1,8,9,10,11,12, 13, även om den fulla potentialen för mogen vuxen och åldrande djur hjärnan skiva och patch clamp inspelning var inte erkännas eller visat i dessa tidigare arbeten. Dessutom fortsätta nyanserad procedurmässiga variationer växa fram för att stödja specifik experimentella program4,14,15,16. Kollektiva kroppen av arbete av dessa många forskargrupper förmedlar högt förtroende i robustheten i de skyddande återställningsmetoden för förbättrad vävnad bevarande. Metoden NMDG skyddande återhämtning har nu allmänt antagits och genomförts i många publicerade studier utnyttjar vuxna djur hjärnan slice preparat. Dessa akuta slice studier span hjärnbarkens3,17,18, Hippocampus15,19,20,21, striatum22 , 23 , 24, mellanhjärnan25,26,27,28,29och hindbrain30,31,32, 33 , 34 regioner, och en mängd signalsubstans och neuromodulator typer inklusive glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,35 ,36, dopaminerga24,29,37,38, kolinerga14,37,38, 39, noradrenerga40och serotonerga27,28 neurotransmission. Metoden lämpar sig också väl för optogenetic kontroll av neuronal aktivitet i skivor som härrör från transgena djur3,39 eller efter i vivo viral injektioner17,27, 28,40,41,42,43, som väl så funktionell Ca2 + avbildning av neuronal aktivitet2,44 ,45,46. Analyser av både kortsiktiga plasticitet4,47,48 och varierande formerna av långsiktiga plasticitet16,35,48 har varit rapporterade. En nyligen genomförd studie tillämpas metoden NMDG skyddande återhämtning för att underlätta omfattande och systematisk sondering av synaptic anslutning i syncentrum i mogen vuxen mus hjärnan skivor med hjälp av den octopatch inspelning konfiguration49 — en kraftfull demonstration av verktyget och robusthet av denna metod. Den skyddande återställningsmetoden har även tillämpats i tidigare oförutsedda experimentella sammanhang, såsom, förbättrad bevarandet av kärlsystemet och pericyter i vuxna kortikala hjärnan skivor50, patch clamp inspelning från transplanterade interneuron populationer i 1-1,5 år gammal Alzheimers sjukdom mus modeller20och en vuxen hjärna slice receptor människohandel assay51.
Följande protokoll beskriver stegvisa procedurer för att genomföra en optimerad NMDG skyddande återställningsmetod hjärnan slice förberedelser att förbättra lönsamheten för akut hjärnskada skivor. Principerna för förbättrad neuronala bevarande diskuteras, samt demonstration av de tydliga fördelarna med denna metod för komplexa multi neuron patch clamp inspelning experiment i både unga vuxna transgena möss hjärnan skivor och mogna vuxna Neurokirurgiska människohjärnan skivor. Följande protokoll har validerats för möss från 21 dagar gamla till mer än ett år gamla, samt när det gäller mänskliga Neurokirurgiska prover från vuxna patienter.

<table style="width:948px;" width="948">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:319px;height:21px;">Compresstome VF-200</td>
			<td style="width:185px;">Precisionary Instruments</td>
			<td style="width:131px;">VF-200</td>
			<td style="width:315px;">Vibrating tissue slicer (recommended)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiourea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td>aCSF constituent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2,2-Tribromoethanol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Anesthetic component 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-methyl-2-butanol&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>240486</td>
			<td>Anesthetic component 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved blunt forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11065-07</td>
			<td>Brain dissection tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine dissecting scissors (supercut)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>Brain dissection tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large heavy duty scissors 7&#39;&#39;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-18</td>
			<td>Brain dissection tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal spatula</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z511455-1PAK</td>
			<td>Brain dissection tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89031-954</td>
			<td>Brain dissection tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain Slice Keeper-4</td>
			<td>Automate Scientific</td>
			<td>S-BSK4</td>
			<td>brain slice holding chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nylon netting&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0198</td>
			<td>For building small slice recovery chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyrex glass beakers (250 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-434</td>
			<td>For building small slice recovery chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm plastic dish, round</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100488-376</td>
			<td>For building small slice recovery chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas diffuser stones (10 &#181;m)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59277</td>
			<td>For constant carbogenation (fine bubbles)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose Type I-B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A0576</td>
			<td>For embedding brain specimens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro loader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22491229</td>
			<td>For filling patch clamp electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td>For making a custom dissecting platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1758-100ML</td>
			<td>For pH adjustment of media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465-25G</td>
			<td>For pH adjustment of media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221473</td>
			<td>For pH adjustment of media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipets 3 mL graduated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89497-676</td>
			<td>For slice transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zirconium ceramic injector blades</td>
			<td>Cadence Specialty Blades</td>
			<td>EF-INZ10</td>
			<td>http://cadenceinc.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KG-33 borosilicate glass capillary w/filament</td>
			<td>King Glass Company</td>
			<td>custom quote</td>
			<td>ID: 0.87mm, OD 1.50mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphocreatine disodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4500-100G</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2-GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51120</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>Intern pipette solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heated water bath (2.5L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:131px;">13491-060</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter paper rounds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28456-022</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000BQRBO6</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-326</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mL syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD302832</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD-309628</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 5/8 gauge needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-292</td>
			<td>Miscellaneous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer (w/1.5 mL tube block)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89232-908</td>
			<td>To keep agarose molten&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute brain slices using an optimized n-methyl-d-glucamine protective recovery method

Detta protokoll är en praktisk guide till N-metyl-D-glucamine (NMDG) skyddande återhämtning framställningsmetod hjärnan slice. Många senare studier har validerat nyttan av denna metod för att öka neuronal bevarande och övergripande hjärnan slice livskraft. Genomförandet av denna teknik av tidiga användare har underlättat detaljerade utredningar av hjärnans funktion med hjälp av experimentell applikationsmöjligheter och som spänner över ett brett utbud av djur åldrar, regioner i hjärnan och celltyper. Stegen beskrivs för att utföra den skyddande återhämtning hjärna slice tekniken använder en optimerad NMDG konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF) media formulering och förbättrade förfarandet att på ett tillförlitligt sätt få friska hjärnan skivor för patch clamp elektrofysiologi. Med detta uppdaterade synsätt, en betydande förbättring observeras i hastigheten och tillförlitligheten hos gigaohm försegla bildandet under riktade patch clamp inspelning experiment bibehållen utmärkt neuronala konservering, därigenom underlätta utmanande experimentella program. Representativa resultat tillhandahålls från flera neuron patch clamp inspelning experiment till assay synaptic anslutning i hjärnbarkens hjärnan skivor tillagad av unga vuxna transgena möss och mogna vuxna människors Neurokirurgiska exemplar. Metoden optimerad NMDG skyddande återhämtning för hjärnan skivning är dessutom kompatibel med både juvenila och vuxna djur, alltså lösa en begränsning av den ursprungliga metoden. Sammanfattningsvis, kan en enda media formulering och hjärnan skivning förfarandet genomföras över olika arter och åldrar att uppnå utmärkta livskraft och vävnad bevarande.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method at JoVE.com

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Detta protokoll visar genomförandet av en optimerad N-metyl-D-glucamine (NMDG) skyddande återhämtning framställningsmetod hjärnan slice. En enda media formulering används för att på ett tillförlitligt sätt få friska hjärnan skivor från djur i alla åldrar och för olika experimentella tillämpningar.

Beredning av akut hjärnskada skivor använder en optimerad N-metyl-D-glucamine skyddande återställningsmetod

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Beredning av Oligomer β-amyloid 1-42 Och induktion av synaptisk plasticitet Nedskrivning av hippocampus Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Beredning av akut subventrikulära zonen Skivor för kalcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal elektroporation och Time-lapse avbildning av neuroblast migration i mus Akut hjärnan skivor

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektro och morfologisk karakterisering av neurala Microcircuits i akut hjärnan skivor Använda Kopplade Patch-Clamp Inspelningar

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Utredning av Synaptic märkning / Capture och Cross-capture använder akut hippocampus skivor från Gnagare

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Optimized Management of Endovascular Treatment for Acute Ischemic Stroke

Optimerad hantering av endovaskulär behandling för akut ischemisk Stroke

This manuscript describes a streamlined protocol for the management of patients with acute ischemic stroke, which aims at the minimization of time from ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

En alternativ metod att studera primära händelser i Neurodegeneration använder Ex Vivo råtta hjärnan skivor

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Beredning av akut ryggmärgen skivor för hela-cell Patch-clamp inspelning i Substantia Gelatinosa nervceller

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Två-foton avbildning av mikrogliala processerna attraktion mot ATP eller Serotonin i akut hjärnskada skivor

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...