Name: determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Vi takker sent Rudy Limburg for opdigte de Kardankryds arm omkreds, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, og Raju Metherate for udlån os udstyr, og Almut Kelber og Kentaro Arikawa, for opmuntring. Dette arbejde blev støttet af en National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship til KJM og NSF tilskud IOS-1.257.627 til ADB

Alle dyr blev behandlet som humant som muligt. Insekter blev afsendt som pupper fra Costa Rica Entomological Supply, Costa Rica. 1. Heliconius Pupper Care <ol><li> Hang alle pupper afstand 2-3 cm fra hinanden i et fugtigt kammer ved hjælp insekt ben. </li><li> Efter eclosion, tillader vinger tørre derefter holde sommerfugle i live i mindst 1 dag i et fugtigt kammer og foder en fortyndet honning løsning dagligt før optagelse. <ol><li> Fortynd honning med vand til omkring en 20% honning løsning i v...

Intracellulær optagelse kan være en vanskelig teknik at mestre grund af de mange tekniske trin involveret. For vellykkede eksperimenter må anses flere vigtige punkter. For det første er det vigtigt at have en korrekt vibrationally-isoleret bord, hvorpå eksperimentet udføres. Mange forskere bruger luft tabeller, som fuldstændig adskiller bordpladen fra basen, hvilket giver overlegen vibrationsisolering. Vores setup indebærer en tyk marmor bord med en sandkasse på toppen, der omgiver scenen apparatet mikromanipul...

De elektriske egenskaber af celler, såsom neuroner observeres ved at måle ion flow over cellemembraner som en ændring i spænding eller strøm. En række elektrofysiologiske teknikker er blevet udviklet til at måle bioelektriske begivenheder i celler. Neuroner fundet i øjnene af dyr er tilgængelige og deres kredsløb er ofte mindre kompleks end i hjernen, hvilket gør disse celler gode kandidater til elektrofysiologisk undersøgelse. Almindelige anvendelser af elektrofysiologi i øjet, omfatter elektroretinografi (ERG) 1,2 og mikroelektrode intracellulær optagelse. ERG indebærer at placere en elektrode i eller på et dyrs øje, anvende en lys-stimulering, og måle ændringen i spænding som en sum af svarene fra alle nærliggende celler 3-6. Hvis man er specielt interesseret i at karakterisere spektrale følsomhed individuelle fotoreceptorceller, ofte flere celletyper samtidigt reagerer på forskellige styrker til en given stimulus; således detkan være vanskeligt at fastlægge følsomheden af ​​specifikke celletyper fra ERG-data, især hvis der er flere forskellige typer af spektralt-lignende fotoreceptorceller i øjet. En mulig løsning er at skabe transgene Drosophila med fotoreceptoren (opsin) genet af interesse udtrykkes i flertallet R1-6 celler i øjet og derefter udføre ERG&#39;er 7. Potentielle ulemper ved denne metode omfatter nej til lav ekspression af fotoreceptor protein 8, og den lange tidshorisont for generering og screening af transgene dyr. For øjnene med færre slags spektralt adskilte fotoreceptorer, kan tilpasning af øjet med farvede filtre hjælpe med at sænke bidraget fra nogle celletyper til ERG, derved tillader estimering af spektral følsomhed maxima 9. Intracellulær optagelse er en anden teknik, hvor et fint elektrode spidder en celle og en stimulus påføres. De elektrode optegnelser kun at individual celle respons, så optagelse fra og analysere flere individuelle celler kan give specifikke følsomhed fysiologisk forskellige celletyper 10-14. Selvom vores protokol fokuserer på analyse af spektrale følsomhed, de grundlæggende principper for intracellulær optagelse med skarpe elektroder er modificerbare til andre formål. Brug af en anden forberedelse af en prøve, for eksempel, og ved hjælp skarpe kvarts elektroder, kan man optage fra dybere i den optiske lap eller andre regioner i hjernen, afhængigt af spørgsmålet bliver stillet. For eksempel, svartider enkelte fotoreceptorceller 15, celle aktivitet i optikken lapper 16 (lamina, medulla eller lobula 17), hjerne 18 eller anden ganglier 19 kan også registreres med lignende teknikker, eller farve stimuli kunne erstattes med polarisering 20 -22 eller bevægelse stimuli 23,24. Fototransduktion, den proces, hvor lysenergi absorberes og omdannes til et elektrokemisk signal, er en gammel træk fælles for næsten alle i dag dyrerækker 25. Den visuelle pigment fundet i fotoreceptorceller og ansvarlig for at iværksætte visuel fototransduktion er rhodopsin. Rhodopsiner i alle dyr består af et opsin protein, et medlem af 7 transmembrane G-protein-koblet receptor familie, og en tilhørende kromofor som er afledt af retinal eller et lignende molekyle 26,27. Opsin aminosyresekvens og kromofor struktur påvirker absorbansen for rhodopsin til forskellige bølgelængder af lys. Når en foton bliver absorberet af kromoforen rhodopsin bliver aktiveret, initiere et G-protein kaskade i den celle, i sidste ende fører til åbningen af membranbundne ionkanaler 28. Modsætning til de fleste neuroner, fotoreceptorer undergår graduerede potentielle ændringer, der kan måles som en relativ ændring i responsamplituden med skiftende lys stimulus. Typisk en givenfotoreceptor typen kun udtrykker én opsin gen (om der findes undtagelser 8,10,29-31). Sofistikeret farvesyn, af den art, der findes i mange hvirveldyr og arthropoder, opnås med en kompleks øje hundredvis eller tusindvis af fotoreceptorceller hver udtrykker en eller nogle gange mere rhodopsin typer. Visuel information indfanges ved at sammenligne reaktioner over fotoreceptor mosaik via kompleks nedstrøms neurale signalering i øjet og hjernen, hvilket resulterer i opfattelsen af ​​et billede komplet med farve og bevægelse. Efter måling af de rå responser af en fotoreceptor celle til forskellige bølgelængder af lys via intracellulær optagelse, er det muligt at beregne sin spektrale følsomhed. Beregningen er baseret på princippet om Univariance, hvori det hedder, at en fotoreceptor celle respons er afhængig af antallet af fotoner det absorberer, men ikke af de særlige egenskaber af fotoner det absorberer 32. Enhver foton der er absorbed af rhodopsin vil inducere den samme reaktion. Dette betyder i praksis, at en celles rå responsamplituden vil stige på grund af enten en stigning i lysintensitet (flere fotoner til at absorbere), eller til et skift i bølgelængde mod sit højdepunkt følsomhed (højere sandsynlighed for rhodopsin absorbere denne bølgelængde). Vi gør brug af dette princip i forbindelse cellulære reaktioner på kendte intensitet og bølgelængde til reaktioner ved forskellige bølgelængder, og den samme intensitet, men ukendte relative følsomhed. Cell typer er ofte identificeret af bølgelængden, hvor deres følsomhed toppe. Her viser vi en metode til intracellulær registrering og analyse af spektrale følsomhed fotoreceptorer i øjet af en sommerfugl, med fokus på at gøre denne metode mere tilgængelig for den bredere forskersamfund. Selvom intracellulær optagelse forbliver almindelige i litteraturen, især med hensyn til farvesyn i insekter, har vi fundet that beskrivelser af materialer og metoder er normalt for kort til at muliggøre reproduktion af teknikken. Vi præsenterer denne metode i videoformat med det formål at tillade dens lettere replikation. Vi beskriver også den teknik bruger let kan indhentes og billig udstyr. Vi løse fælles advarsler, som ofte ikke indberettes, hvilket bremser forskning, når optimere en ny og kompleks teknik.

determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings

Intracellulær optagelse er en kraftfuld teknik anvendes til at bestemme, hvordan en enkelt celle kan reagere på en given stimulus. I vision forskning har intracellulær optagelse historisk set været en udbredt teknik til at studere følsomhed individuelle fotoreceptorceller til forskellige lys stimuli, som stadig bliver brugt i dag. Der er dog stadig en ringe detaljeret metode i litteraturen for forskere, der ønsker at kopiere intracellulære optagelse eksperimenter i øjet. Her præsenterer vi insektet som model for behandlingen af ​​øjet fysiologi mere generelt. Insektceller fotoreceptorceller er placeret nær overfladen af ​​øjet og er derfor let at nå, og mange af de involverede i et syn mekanismer er konserveret på tværs dyrerækker. Vi beskriver den grundlæggende fremgangsmåde til in vivo intracellulær optagelse af fotoreceptorceller i øjet af en sommerfugl, med målet om at gøre denne teknik mere tilgængelig for forskere med lidt forudgående erfaring i electrophysiology. Vi introducerer den grundlæggende nødvendige udstyr, hvordan man forbereder en levende sommerfugl til optagelse, hvordan du indsætter et glas mikroelektrode i en enkelt celle, og endelig proceduren optagelse selv. Vi forklarer også den grundlæggende analyse af rå respons data til bestemmelse spektral følsomhed enkelte celletyper. Selvom vores protokol fokuserer på fastlæggelse spektral følsomhed, andre stimuli (f.eks polariseret lys) og variationer af metoden kan anvendes på denne opsætning.

For mange elementer i opsætningen optagelse, er en skriftlig beskrivelse ikke give nok detaljer. Figur 1 er en skematisk af de involverede i det komplette indspilning setup komponenter. I figur 2 er spektre afbildet for hvidt lys og hver interferensfilter for at give en fornemmelse af, hvorfor en korrektionsfaktor er nødvendig, og hvad der er behov for at beregne denne korrektion. Figur 3 viser billeder og et diagram over Cardan arm, der anvendes til disse ek...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Den elektrofysiologisk teknik af intracellulær optagelse påvises og anvendes til bestemmelse spektrale følsomheder af enkelte fotoreceptorceller i forbindelsen øjet af en sommerfugl.

Bestemmelse af Lysmodtageren Cell spektral følsomhed en Insect Model fra<em&gt; In vivo</em&gt; Intracellulære optagelser

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograd fluorescensmærkning Tillader Målrettet Extracellular Single-unit Optagelse fra Identificerede Neuroner<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Forbundne Helcelle optagelser i Organotypiske hippocampusskiver

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

En enkel og billig metode til bestemmelse Kolde Følsomhed og tilpasning i mus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidige<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functional Test af to nethinder af<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...