Name: determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Vi takker for sent Rudy Limburg for fabrikasjon av driv arm omkrets, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, og Raju Metherate for utlån oss utstyr, og Almut Kelber og Kentaro Arikawa, for oppmuntring. Dette arbeidet ble støttet av et National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship til KJM og NSF tilskuddet IOS-1257627 til ADB

Alle dyrene ble behandlet som humant som mulig. Insekter ble sendt som puppe fra Costa Rica Entomological Supply, Costa Rica. 1. Heliconius puppe Care <ol><li> Hang alle puppe plassert 2-3 cm fra hverandre i en fuktet kammer bruker insekt nålene. </li><li> Etter eklosjonshormon, la vingene til tørk deretter holde sommerfugler i live i minst en dag i en fuktet kammer og mate en fortynnet honning løsning daglig før opptak. <ol><li> Fortynn honning med vann til ca 20% honning løsning av volum, og he...

Intracellulære opptaket kan være en vanskelig teknikk å mestre på grunn av de mange tekniske trinnene involvert. For vellykkede eksperimenter flere viktige punkter må vurderes. For det første er det viktig å ha et godt vibrasjonsisolert bord på hvilken forsøket blir utført. Mange forskere bruker uteservering, som fullstendig skille bordplaten fra basen, noe som gir overlegen vibrasjonsisolering. Vår involverer en tykk marmor bord med en sandkasse på toppen, der er plassert mikromanipluatoren / elektrodeholde...

De elektriske egenskaper til celler slik som nerveceller observeres ved å måle ion strømmen over cellemembraner som en endring i spenning eller strøm. En rekke elektrofysiologiske teknikker er blitt utviklet for å måle bioelektriske hendelser i cellene. Nerveceller som finnes i øynene til dyrene er tilgjengelige og deres kretser er ofte mindre komplisert enn i hjernen, noe som gjør disse cellene gode kandidater for elektrofysiologisk undersøkelse. Vanlige anvendelser av elektro i øyet inkluderer elektroretinografi (ERG) 1,2 og microelectrode intracellulære opptaket. ERG innebærer å plassere en elektrode i eller på øyet hos et dyr, å påføre en lett stimulus, og måle endringen i spenningen som en sum av responsene til alle nærliggende celler 3-6. Hvis man er spesielt interessert i å karakterisere spektrale følsomheten til enkelt fotoreseptorcellene, ofte flere celletyper samtidig svare på ulike styrker til et gitt stimulus; dermed detkan være vanskelig å bestemme sensitiviteter av spesifikke celletyper fra ERG data, spesielt hvis det finnes flere forskjellige typer spektralt-lignende fotoreseptorcellene i øyet. En mulig løsning er å lage transgene Drosophila med fotoreseptoren (opsin) genet uttrykkes i de fleste R1-6 celler i øyet og deretter utføre erg 7. Mulige ulemper ved denne metoden er ikke til lav-ekspresjon av fotoreseptoren protein 8, og den lange tid rammen for generering og screening av transgene dyr. For øynene med færre typer spektralt forskjellige fotoreseptorer, kan tilpasning av øyet med fargede filtre hjelpe til med å senke bidraget fra enkelte celletyper til ERG, og dermed tillater estimering av spektral følsomhet maxima 9. Intracellulære opptaket er en annen teknikk der en fin elektrode impales en celle og en stimulus er brukt. Elektrode poster bare at individual celle respons, slik at opptak fra og analysere flere enkeltceller kan gi bestemte følsom av fysiologisk forskjellige celletyper 10-14. Selv om vår protokoll fokuserer på analyse av spektral følsomhet, de grunnleggende prinsipper for intracellulær opptak med skarpe elektroder er modifiserbare for andre programmer. Ved hjelp av en annen forberedelse av en prøve, for eksempel, og bruk skarpe kvarts elektroder, kan man ta opp fra dypere i den optiske lapp eller andre regioner i hjernen, avhengig av spørsmålet blir stilt. For eksempel, reaksjonstider på individuelle fotoreseptorcellene 15, celleaktivitet i den optiske fliker 16 (lamina, marg eller lobula 17), hjerne 18 eller annen ganglier 19, kan også registreres med lignende teknikker, eller farge stimuli kan bli erstattet med polarisasjon 20 -22 eller bevegelse stimuli 23,24. Fototransduksjonskaskade, prosessen ved hvilken lysetenergi absorberes og omdannes til en elektrokjemisk signal, er en gammel egenskap som er felles for nesten alle dagens dyr phyla 25. Den visuelle pigment funnet i fotoreseptorcellene og ansvaret for å initiere visuell fototransduksjonskaskade er rhodopsin. Rhodopsins i alle dyr er bygd opp av en opsin protein, et medlem av syv transmembran G-protein-koblet reseptor-familien, og en tilhørende kromofor som er avledet fra retinal eller et lignende molekyl 26,27. Opsin aminosyresekvens og kromofor struktur påvirke absorbansen Rhodopsin til forskjellige bølgelengder av lys. Når et foton absorbert ved kromoforen den rhodopsin blir aktivert, igangsetter en G-protein kaskade i den celle som til slutt fører til åpning av membranbundne ionekanaler 28. I motsetning til de fleste nevroner, fotoreseptorcellene gjennomgå graderte mulige endringer som kan måles som en relativ endring i respons amplitude med skiftende lys stimulans. Vanligvis en gittfotoreseptoren typen uttrykker bare en opsin gen (men unntak finnes 8,10,29-31). Sofistikert fargesyn, av den typen som finnes i mange virveldyr og leddyr, oppnås med en kompleks øye av hundrevis eller tusenvis av fotoreseptorcellene hver uttrykker en eller noen ganger flere rhodopsin typer. Visuell informasjon registreres ved å sammenligne responsene over fotoreseptoren mosaikk via kompleks nedstrøms nevrale signalering i øyet og hjernen, noe som resulterer i oppfatningen av et bilde med farge og bevegelse. Etter måling av de rå responsene til en fotoreseptor celle til forskjellige bølgelengder av lys via intracellulære opptaket, er det mulig å beregne den spektrale følsomhet. Denne beregningen er basert på prinsippet om Univariance, som sier at en fotoreseptoren celle respons er avhengig av antall fotoner det absorberer, men ikke på de spesielle egenskapene til fotoner det absorberer 32. Enhver foton som er absorbed av rhodopsin vil indusere samme type respons. I praksis betyr dette at en celle rå respons amplitude vil øke på grunn av enten en økning i lys intensitet (flere fotoner til å absorbere), eller til en endring i bølgelengde mot sin topp følsomhet (høyere sannsynlighet for rhodopsin absorberende at bølgelengde). Vi gjør bruk av dette prinsipp i forbindelse cellulære responser på kjente intensitet og den samme bølgelengde for å responser ved forskjellige bølgelengder, og det samme intensitet men ukjent relativ følsomhet. Celletyper er ofte identifisert ved den bølgelengde ved hvilken deres følsomhet topper. Her viser vi en metode for intracellulær registrering og analyse av spektral følsomhet av fotoreseptorene i øyet av en sommerfugl, med fokus på å gjøre denne metoden mer tilgjengelig for bredere forskningsmiljø. Selv om det intracellulære opptaket er fortsatt vanlig i litteraturen, spesielt med hensyn til fargesynet i insekter, har vi funnet that beskrivelser av materialer og metoder som vanligvis er for kort for å muliggjøre gjengivelse av teknikken. Vi presenterer denne metoden i videoformat med sikte på å tillate det lettere replikasjon. Vi beskriver også teknikk med lett tilgjengelig og rimelig utstyr. Vi tar vanlige begrensninger som ofte ikke blir rapportert som tregere forskning når du optimaliserer en ny og komplisert teknikk.

determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings

Intracellulære opptaket er en kraftfull teknikk som brukes for å bestemme hvordan en enkelt celle kan svare på et gitt stimulus. I visjonen forskning, har intracellulære opptaket historisk vært en vanlig teknikk som brukes til å studere sensitiviteten for enkelt fotoreseptorcellene til forskjellige lys stimuli som fortsatt blir brukt i dag. Men det er fortsatt en mangel på detaljerte metoder i litteraturen for forskere som ønsker å gjenskape intracellulære opptak eksperimenter i øyet. Her presenterer vi insekt som en modell for å undersøke øyet fysiologi mer generelt. Insekt fotoreseptorcellene er plassert nær overflaten av øyet og er derfor lett tilgjengelig, og mange av de som er involvert i syn mekanismer er konservert på tvers av dyr phyla. Vi beskriver den grunnleggende prosedyren for in vivo intracellulære opptaket av fotoreseptorcellene i øyet av en sommerfugl, med mål om å gjøre denne teknikken mer tilgjengelig for forskere med liten tidligere erfaring i electrophysiology. Vi introduserer den grunnleggende utstyr som trengs, hvordan å forberede en levende sommerfugl for opptak, hvordan du setter inn et glass microelectrode i en enkelt celle, og endelig opptaksprosedyren selv. Vi forklarer også den grunnleggende analyse av rå responsdata for å bestemme spektralfølsomheten til individuelle celletyper. Selv om vår protokoll fokuserer på å bestemme spektrale følsomhet, andre stimuli (f.eks polarisert lys) og varianter av metoden gjelder for dette oppsettet.

For mange elementer av opptaket oppsett, betyr en skrevet beskrivelse ikke gi tilstrekkelig detalj. Figur 1 er et skjematisk riss av de som er involvert i den komplette opptak oppsettet komponenter. I figur 2 er spektra plottet for hvitt lys og hvert interferensfilter for å gi en følelse av at en korreksjonsfaktor som er nødvendig og hva som er nødvendig for å beregne denne korreksjonen. Figur 3 viser fotografier og et diagram av Cardan armen som benyttes ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Den elektroteknikk av intracellulært opptak blir demonstrert, og brukes til å bestemme spektrale følsomheten til enkelt fotoreseptorcellene i sammensatt øyet av en sommerfugl.

Fastsettelse av fotoreseptorlidelser Cell Spectral følsomhet i en Insect modell fra<em&gt; I Vivo</em&gt; Intracellulære Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Merking Tillater målrettet Ekstracellulær Single-enhet Opptak fra Identifiserte Nerveceller<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Elektrofysiologiske Opptak av Synaptically-fremkalt Astroglial og Neuronal Responses i akutt hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Sammenkoblede hele cellen Recordings i organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

En enkel og rimelig metode for å bestemme Cold Følsomhet og Adaptation i Mus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...