Name: determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Agradecemos a finales Rudy Limburg para fabricar el perímetro del brazo de cardán, Kimberly Jamison, Mateo McHenry, y Raju Metherate por prestarnos el equipo, y Almut Kelber y Kentaro Arikawa, para el estímulo. Este trabajo fue apoyado por una Fundación Nacional de Ciencia (NSF) Licenciado beca de investigación para KJM y NSF IOS-1.257.627 a ADB

Todos los animales fueron tratados lo más humanamente posible. Los insectos fueron enviados como pupas de Costa Rica entomológica de alimentación, Costa Rica. 1. Cuidado de Heliconius pupas <ol><li> Colgar todas las pupas espaciados 2-3 cm de distancia en una cámara húmeda usando pasadores de insectos. </li><li> Después de la eclosión, permiten que las alas se sequen y luego mantener viva mariposas durante al menos 1 día en una cámara húmeda y se alimentan de una solución diluida de miel to...

registro intracelular puede ser una técnica difícil de dominar debido a los muchos pasos técnicos involucrados. Para los experimentos con éxito varios puntos importantes deben ser considerados. En primer lugar, es importante tener una mesa adecuadamente aislado vibratoriamente-en el que se realiza el experimento. Muchos investigadores utilizan mesas de aire, que separan completamente de la mesa de la base, dando el aislamiento de vibración superior. Nuestra configuración consiste en una mesa de mármol de espesor ...

Las propiedades eléctricas de las células tales como neuronas se observan mediante la medición de flujo de iones a través de las membranas celulares como un cambio en el voltaje o la corriente. Una variedad de técnicas electrofisiológicas han sido desarrollados para medir eventos bioeléctricos en las células. Las neuronas que se encuentran en los ojos de animales son accesibles y sus circuitos a menudo es menos compleja que en el cerebro, por lo que estas células buenos candidatos para el estudio electrofisiológico. Las aplicaciones más comunes de electrofisiología en el ojo incluyen el electrorretinograma (ERG) 1,2 y el registro intracelular de microelectrodos. ERG consiste en colocar un electrodo en o sobre el ojo de un animal, la aplicación de un estímulo de luz, y midiendo el cambio en la tensión como una suma de las respuestas de todas las células cercanas 3-6. Si uno está interesado específicamente en la caracterización de las sensibilidades espectrales de las células fotorreceptoras individuales, a menudo múltiples tipos de células responden de forma simultánea en diferentes puntos fuertes a un estímulo determinado; Por lo tanto,puede ser difícil de determinar las sensibilidades de los tipos celulares específicos a partir de datos ERG especialmente si hay varios tipos diferentes de células fotorreceptoras espectralmente similares en el ojo. Una posible solución es crear transgénico con el gen de Drosophila fotorreceptor (opsina) de interés se expresa en las células mayoría R1-6 en el ojo y después realizar ERGs 7. Las posibles desventajas de este método son que no a baja expresión de la proteína fotorreceptor 8, y el período de tiempo largo para la generación y detección de animales transgénicos. Para los ojos con un menor número de tipos de fotorreceptores espectralmente distintas, la adaptación del ojo con filtros de color puede ayudar con la reducción de la contribución de algunos tipos de células a la ERG, permitiendo de ese modo la estimación de máximos sensibilidad espectral 9. registro intracelular es otra técnica en la que una multa electrodo empala una célula y se aplica un estímulo. Los registros de electrodos sólo eso IndivLa respuesta de las células idual de manera que a grabar y analizar varias celdas individuales puede producir sensibilidades específicas de los diferentes tipos de células fisiológicamente 10-14. Aunque nuestro protocolo se centra en el análisis de sensibilidad espectral, los principios básicos de intracelular de grabación con electrodos afilados son modificables para otras aplicaciones. El uso de una preparación diferente de una muestra, por ejemplo, y el uso de electrodos de cuarzo afilados, se puede grabar de más profundo en el lóbulo óptico o de otras regiones en el cerebro, dependiendo de la pregunta que se hace. Por ejemplo, los tiempos de respuesta de las células fotorreceptoras individuales 15, la actividad de células en la óptica lóbulos 16 (lámina, médula o lobula 17), cerebro 18 o otros ganglios 19 también se pueden grabar con técnicas similares, o estímulos de color podría sustituirse con polarización 20 -22 o moción estímulos 23,24. Fototransducción, el proceso por el cual la luzla energía es absorbida y convertida en una señal electroquímica, es un antiguo rasgo común a casi todos los presentes el día 25 filos animales. El pigmento visual que se encuentra en las células fotorreceptoras y responsable de iniciar la fototransducción visual es la rodopsina. Rhodopsins en todos los animales se componen de una proteína opsina, un miembro de la familia 7 transmembrana G receptor acoplado a la proteína, y un cromóforo asociado que se deriva de la retina o una molécula similar 26,27. Opsin secuencia de aminoácidos y la estructura de cromóforo afectar la absorbancia de la rodopsina a diferentes longitudes de onda de luz. Cuando un fotón es absorbida por el cromóforo de la rodopsina se activa, iniciando una cascada de proteína G en la célula que en última instancia conduce a la apertura de los canales iónicos de membrana 28. A diferencia de la mayoría de las neuronas, las células fotorreceptoras se someten a posibles cambios graduales que se pueden medir como un cambio relativo en la amplitud de la respuesta con el cambio de estímulo luminoso. Normalmente, un dadotipo de fotorreceptor expresa sólo un gen de la opsina (aunque existen excepciones 8,10,29-31). la visión del color sofisticado, de la que se encuentra en muchos vertebrados y artrópodos, se consigue con un ojo complejo de cientos o miles de células fotorreceptoras cada que expresan uno o más tipos de vez en cuando rodopsina. La información visual se captura mediante la comparación de las respuestas sobre el mosaico fotorreceptor través de la señalización neural aguas abajo complejo en el ojo y el cerebro, dando como resultado la percepción de una imagen completa con el color y el movimiento. Después de medir las respuestas primas de una célula fotorreceptora a diferentes longitudes de onda de luz a través de registro intracelular, es posible calcular su sensibilidad espectral. Este cálculo se basa en el principio de univariante, que establece que la respuesta de una de las células fotorreceptoras depende del número de fotones que absorbe, pero no en las propiedades particulares de los fotones que absorbe 32. Cualquier fotón que es absorbed por rodopsina inducirá el mismo tipo de respuesta. En la práctica, esto significa que la amplitud de la respuesta en bruto de una célula aumentará ya sea debido a un aumento en la intensidad de la luz (más fotones para absorber), o a un cambio en la longitud de onda hacia su sensibilidad pico (mayor probabilidad de rodopsina de absorción de esa longitud de onda). Hacemos uso de este principio en relacionar las respuestas celulares a una intensidad conocida y la misma longitud de onda de respuestas a diferentes longitudes de onda y la misma intensidad pero la sensibilidad relativa desconocida. Los tipos de células a menudo se identifican por la longitud de onda a la que sus picos de sensibilidad. Aquí se muestra un método para el registro y análisis de sensibilidad espectral de los fotorreceptores en el ojo de una mariposa intracelular, con un enfoque en lo que este método sea más accesible para la comunidad científica en general. Aunque registro intracelular sigue siendo común en la literatura, particularmente con respecto a la visión de color en los insectos, hemos encontrado that descripciones de materiales y métodos son por lo general demasiado breve para permitir la reproducción de la técnica. Presentamos este método en el formato de vídeo con el fin de permitir su replicación más fácil. También describimos la técnica utilizando un equipo fácil de obtener y asequible. Nos dirigimos advertencias comunes que a menudo no son reportados, que ralentizan la investigación la hora de optimizar una nueva y compleja técnica.

determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings

registro intracelular es una técnica poderosa utilizada para determinar cómo una sola célula puede responder a un estímulo dado. En la investigación de la visión, el registro intracelular ha sido históricamente una técnica común utilizada para estudiar la sensibilidad de las células fotorreceptoras individuales a diferentes estímulos luminosos que se sigue utilizando hoy en día. Sin embargo, sigue habiendo una escasez de metodología detallada en la literatura para los investigadores que desean replicar experimentos registro intracelular en el ojo. Aquí se presentan los insectos como modelo para examinar la fisiología del ojo de manera más general. células fotorreceptoras de insectos se encuentran cerca de la superficie del ojo y por lo tanto son fáciles de alcanzar, y muchos de los mecanismos implicados en la visión se conservan a través de filos animal. Se describe el procedimiento básico para la grabación intracelular in vivo de las células fotorreceptoras en el ojo de una mariposa, con el objetivo de hacer que esta técnica sea más accesible a los investigadores con poca experiencia previa en el correolectrophysiology. Introducimos el equipo básico necesario, cómo preparar una mariposa en vivo para la grabación, la forma de insertar un microelectrodo de vidrio en una sola celda, y, finalmente, el procedimiento de grabación en sí. También se explica el análisis básico de datos de respuesta primas para la determinación de la sensibilidad espectral de distintos tipos de células. Aunque nuestro protocolo se centra en la determinación de la sensibilidad espectral, otros estímulos (por ejemplo, luz polarizada) y variaciones del método son aplicables a esta configuración.

Para muchos elementos de la configuración de la grabación, una descripción escrita no proporciona suficiente detalle. La Figura 1 es un esquema de los componentes involucrados en el sistema de grabación completa. En la Figura 2, los espectros se trazan para la luz blanca y cada filtro de interferencia para dar una idea de por qué se necesita un factor de corrección y lo que se necesita para calcular esta corrección. La figura 3 muestra fotos y un diagram...

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Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

La técnica electrofisiológica de registro intracelular se demuestra y se utiliza para determinar las sensibilidades espectrales de las células fotorreceptoras individuales en el ojo compuesto de una mariposa.

Determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos<em&gt; En Vivo</em&gt; registros intracelulares

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Una sola unidad En vivo Grabaciones de la quiasma óptico de la rata

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Diseño y montaje de un Microdrive ultraligero motorizado para crónicos Grabaciones neuronales en Pequeños Animales

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Un método simple y barato para la Determinación de la sensibilidad al frío y Adaptación en ratones

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...