Name: determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Vi tackar sena Rudy Limburg för att tillverka kraftöverförings arm omkrets, Kimberly Jamison, Matthew McHenry och Raju Metherate för utlåning oss utrustning, och Almut Kelber och Kentaro Arikawa, för uppmuntran. Detta arbete stöddes av National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship till KJM och NSF bidrag IOS-1.257.627 till ADB

Samtliga djur behandlades så mänskligt som möjligt. Insekter sändes som puppor från Costa Rica Entomological Supply, Costa Rica. 1. Heliconius Puppor Care <ol><li> Hang alla puppor avstånd 2-3 cm från varandra i en fuktig kammare med hjälp av insekter stift. </li><li> Efter eclosion Låt vingar torka sedan hålla fjärilar vid liv åtminstone en dag i en fuktig kammare och mata en utspädd honung lösning dagligen före inspelning. <ol><li> Späd honung med vatten till ca 20% honung lösning i...

Intracellulära inspelning kan vara en svår teknik att bemästra på grund av de många tekniska stegen. För framgångsrika experiment flera viktiga punkter måste beaktas. Det första är det viktigt att ha en korrekt vibrationsmässigt isolerad bord på vilket experimentet utförs. Många forskare använder luft tabeller som helt separata bordsskivan från basen, vilket ger överlägsen vibrationsisolering. Vår inställning innebär en tjock marmorbord med en sandlåda på toppen, i vilken är placerad mikromanipul...

De elektriska egenskaperna hos celler såsom neuroner observeras genom mätning av jonflöde över cellmembran som en förändring i spänning eller ström. En mängd olika elektrofysiologiska tekniker har utvecklats för att mäta bioelektriska händelser i celler. Nervceller som finns i ögonen hos djur är tillgängliga och deras kretsar är ofta mindre komplicerad än i hjärnan, vilket gör dessa celler goda kandidater för elektro studie. Vanliga tillämpningar av elektrofysiologi i ögat innefattar elektroretinografi (ERG) 1,2 och mikro intracellulära inspelning. ERG innebär att placera en elektrod i eller på ögat hos ett djur, med ett lätt stimulus och mätning av förändringen i spänning som en summa av svaren från alla närliggande celler 3-6. Om man är särskilt intresserad av att karakterisera spektrala känslighet enskilda ljusmätare celler, ofta flera celltyper samtidigt svara på olika styrkor till en viss stimulans, sålunda detkan vara svårt att avgöra känsligheten hos specifika celltyper från ERG uppgifter särskilt om det finns flera olika typer av spektralt liknande fotoreceptorceller i ögat. En möjlig lösning är att skapa transgena Drosophila med ljusmätare (opsin) gen av intresse uttrycks i majoriteten R1-6 cellerna i ögat och sedan utföra ERG 7. Potentiella nackdelar med denna metod inkluderar nej till låg expression av fotoreceptor-protein 8 och den långa tidsramen för generering och screening av transgena djur. För ögonen med färre typer av spektralt distinkta fotoreceptorer, kan anpassning av ögat med färgade filter hjälpa till med att sänka bidraget från vissa celltyper till ERG, varigenom uppskattning av spektral känslighet maxima 9. Intracellulära inspelning är en annan teknik där en fin elektrod spetsar en cell och en stimulans tillämpas. Elektrod poster endast att individual cellens svar så att inspelning från och analysera flera enskilda celler kan ge specifika känsligheter fysiologiskt olika celltyper 10-14. Även om våra protokoll fokuserar på analys av spektrala känslighet, de grundläggande principerna för intracellulär inspelning med skarpa elektroder är modifierbara för andra tillämpningar. Med hjälp av en annan beredning av ett prov, till exempel, och med vassa kvarts elektroder, kan en spela in från djupare i synnerven lob eller andra regioner i hjärnan, beroende på den fråga som ställdes. Exempelvis svarstider av individuella fotoreceptorceller 15, cellaktivitet i optiken loberna 16 (lamina, medulla eller lobula 17), hjärna 18 eller annan ganglier 19 kan också spelas in med liknande tekniker, eller färg stimuli kunde ersättas med polarisation 20 -22 eller rörelse stimuli 23,24. Ljusöverledningen, den process genom vilken ljusenergi absorberas och omvandlas till en elektrokemisk signal, är en gammal egenskap gemensam för nästan alla dagens djur phyla 25. Den visuella pigment som finns i ljusmätare celler och ansvarig för att initiera visuell ljusöverledningen är rhodopsin. Rodopsin i alla djur är uppbyggda av en opsin protein, en medlem av den 7 transmembran G-proteinkopplade receptorfamiljen, och en tillhörande kromofor som är härledd från retinal eller en liknande molekyl 26,27. Opsin aminosyrasekvens och kromofor struktur påverkar absorbansen av rhodopsin till olika ljusvåglängder. När en foton absorberas av kromoforen den rodopsin blir aktiverad, initiera en G-protein kaskad i cellen som i slutändan leder till öppnandet av membranbundna jonkanaler 28. Till skillnad från de flesta neuroner, ljusmätare celler genomgå graderade eventuella förändringar som kan mätas som en relativ förändring som svar amplitud med skiftande ljus stimulans. Typiskt en givenfotoreceptor typ uttrycker endast en opsin gen (även om undantag finns 8,10,29-31). Sofistikerad färgseende, av det slag som finns i många ryggradsdjur och leddjur, uppnås med ett komplext öga av hundratals eller tusentals ljusmätare celler vardera uttrycker en eller ibland flera rhodopsin typer. Visuell information fångas genom att jämföra svaren över fotoreceptorn mosaik via komplexa nedströms neurala signaleringen i ögat och hjärnan, vilket resulterar i uppfattningen av en bild komplett med färg och rörelse. Efter mätning av den råa svar av en ljusmätare cell till olika våglängder av ljus via intracellulära inspelning, är det möjligt att beräkna dess spektrala känslighet. Denna beräkning bygger på principen om Univariance, där det sägs att en ljusmätare cell svar är beroende av antalet fotoner det absorberar, men inte på de särskilda egenskaperna hos de fotoner absorberar 32. Någon fotonen som är absorbed av rhodopsin kommer att framkalla samma typ av svar. I praktiken innebär detta att en cell rå responsamplitud kommer att öka på grund av antingen en ökning av ljusintensitet (fler fotoner att absorbera), eller en förskjutning i våglängd mot sin topp känslighet (högre sannolikhet för rhodopsin absorbera den våglängden). Vi utnyttjar denna princip i rör cellulära svar på kända intensitet och samma våglängd till svar på olika våglängder och samma intensitet men okända relativa känsligheten. Celltyper identifieras ofta av den våglängd vid vilken deras känslighetstoppar. Här visar vi en metod för intracellulär registrering och analys av spektrala känslighet fotoreceptorer i ögat av en fjäril, med fokus på att göra den här metoden mer tillgänglig för en bredare forskarsamhället. Även intracellulära inspelning fortfarande vanligt i litteraturen, i synnerhet med avseende på färgseendet hos insekter, har vi funnit that beskrivningar av material och metoder är oftast alltför kort för att medge reproduktion av tekniken. Vi presenterar denna metod i videoformat med syfte att tillåta dess lättare replikering. Vi beskriver också den teknik med hjälp av lätt erhållas och prisvärd utrustning. Vi vänder oss till vanliga varningar som ofta inte redovisas, vilket bromsar forskning när man optimerar en ny och komplicerad teknik.

determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings

Intracellulära inspelning är en kraftfull teknik som används för att avgöra hur en enda cell kan svara på en viss stimulans. I Vision Research, har intracellulära inspelning historiskt varit en vanlig teknik som används för att studera känsligheten hos individuella ljusmätare celler till olika ljus stimuli som fortfarande används idag. Det finns dock fortfarande en brist på detaljerad metod i litteraturen för forskare som vill replikera intracellulära inspelning experiment i ögat. Här presenterar vi insekten som en modell för att undersöka ögat fysiologi mer generellt. Insektsljusmätare celler ligger nära ytan av ögat och är därför lätt att nå, och många av de mekanismer som är involverade i en syn bevaras över djur phyla. Vi beskriver den grundläggande proceduren för in vivo intracellulära inspelning av fotoreceptorceller i ögat av en fjäril, med målet att göra den här tekniken mer tillgänglig för forskare med liten tidigare erfarenhet av electrophysiology. Vi introducerar den grundläggande utrustning som behövs, hur man förbereder en levande fjäril för inspelning, hur man sätter en glasmikro till en enda cell, och slutligen förfarandet inspelningen själv. Vi förklarar också den grundläggande analysen av råsvarsdata för att bestämma spektrala känsligheten hos enskilda celltyper. Även om våra protokoll fokuserar på att bestämma spektrala känslighet, andra stimuli (t.ex. polariserat ljus) och variationer av metoden kan tillämpas på denna inställning.

För många delar av inspelningen setup, gör en skriftlig beskrivning inte tillräckligt detaljerat. Figur 1 är en schematisk bild av de komponenter som hela inspelningen setup. I figur 2, är spektra ritas upp för vitt ljus och varje interferensfilter för att ge en känsla av varför en korrektionsfaktor som behövs och vad som krävs för att beräkna denna korrektion. Figur 3 visar bilder och ett diagram över Cardan arm som används för dessa experimen...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Den elektrotekniken av intracellulära inspelning demonstreras och används för att bestämma spektrala känslighet av enstaka fotoreceptorceller i föreningen ögat av en fjäril.

Fastställande av fotoreceptor Cell spektral känslighet i en insekt modell från<em&gt; In Vivo</em&gt; Intracellulära Record

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Single-enhet In vivo Inspelningar från Optic Chiasm av Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Bakåtsträvande Fluorescerande märkning Tillåter Riktade Extracellular Single-enhet Inspelning från identifierade nervceller<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

Konstruktion och montering av en Motoriserad Ultralätt Microdrive för kronisk neurala inspelningar i små djur

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Samtidiga Hel-Inspelningar från fotoreceptorer och andra ordningens neuron i ett Amfibie näthinnan Slice Förberedelser

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

En enkel och billig metod för bestämning Cold Känslighet och anpassning hos möss

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...