Name: multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos
Uploaded: 2016-01-31T15:00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos at JoVE.com

We thank our colleagues for cDNA plasmids for template generation. The authors' work is supported by the Swedish Cancer Foundation (CAN 2010/553), the Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (IG2011-2042) and the Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2012.0058).

<ol>
	<li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In Situ Hybridization Methods. , (2015).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846 (2004).</li><li>Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+transcripts+with+probes+and+imaging+technology.">Validating transcripts with probes and imaging technology.</a> Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).</li><li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization:+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules.">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> Bmb Reports. 46 (2), 65-72 (2013).</li><li>Speel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robert+Feulgen+Prize+Lecture+1999.+Detection+and+amplification+systems+for+sensitive,+multiple-target+DNA+and+RNA+in+situ+hybridization:+looking+inside+cells+with+a+spectrum+of+colors.">Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors.</a> Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).</li><li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex.">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Hartmann, C., J&#228;ckle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+relationships+between+a+novel+Drosophila+stripe+expressing+gene+and+known+segmentation+genes+by+simultaneous+visualization+of+transcript+patterns.">Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns.</a> Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).</li><li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+detection+of+mRNA+transcript+localizations+in+fish+and+fly+embryos+using+alkaline+phosphatase+and+beta-galactosidase+conjugated+antibodies.">Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies.</a> Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).</li><li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-,+two-,+and+three-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos.">One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Methods. 23 (4), 359-372 (2001).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+vertebrate+and+Drosophila+embryos.">Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos.</a> Trends Genet. 10 (8), 266 (1994).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolour+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos.">Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).</li><li>O'Neill, J. W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-label+in+situ+hybridization+using+biotin+and+digoxigenin-tagged+RNA+probes.">Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes.</a> Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).</li><li>S&#246;ll, I., Hauptmann, G., G, H. a. u. p. t. m. a. n. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolored+visualization+of+transcript+distributions+in+Drosophila+embryos.">Multicolored visualization of transcript distributions in Drosophila embryos.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 45-59 (2015).</li><li>Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalyzed+reporter+deposition,+a+novel+method+of+signal+amplification.+Application+to+immunoassays.">Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays.</a> J Immunol Methods. 125 (1-2), 279-285 (1989).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+whole-mount+in+situ+hybridization.">Multicolor whole-mount in situ hybridization.</a> Methods Mol Biol. 137, 139-148 (2000).</li><li>S&#246;ll, I., Hauptmann, G., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+and+automated+whole-mount+in+situ+hybridization+for+systematic+gene+expression+analysis+in+embryonic+zebrafish+forebrain.">Manual and automated whole-mount in situ hybridization for systematic gene expression analysis in embryonic zebrafish forebrain.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 171-206 (2015).</li><li>Bergalet, J., et al., Hauptmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+transcript+localization+in+Drosophila+embryos+and+tissues+visualized+by+multiplex+FISH.">Subcellular transcript localization in Drosophila embryos and tissues visualized by multiplex FISH.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 369-391 (2015).</li><li>Walldorf, U., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empty+spiracles,+a+gap+gene+containing+a+homeobox+involved+in+Drosophila+head+development.">Empty spiracles, a gap gene containing a homeobox involved in Drosophila head development.</a> Embo J. 11 (6), 2247-2259 (1992).</li><li>Hafen, E., Kuroiwa, A., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+transcripts+from+the+segmentation+gene+fushi+tarazu+during+Drosophila+embryonic+development.">Spatial distribution of transcripts from the segmentation gene fushi tarazu during Drosophila embryonic development.</a> Cell. 37 (3), 833-841 (1984).</li><li>Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+sloppy+paired+locus+encodes+two+proteins+involved+in+segmentation+that+show+homology+to+mammalian+transcription+factors.">The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors.</a> Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).</li><li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+gene+expression+patterns+reveal+transverse+and+longitudinal+subdivisions+of+the+embryonic+zebrafish+forebrain.">Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).</li><li>Long, S., Rebagliati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+two-color+whole-mount+in+situ+hybridizations+using+digoxygenin-+and+dinitrophenol-labeled+RNA+probes.">Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes.</a> Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (1), 10 (2011).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+using+enhanced+tyramide+signal+amplification.">Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification.</a> Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).</li><li>Chen, J., Laramore, C., Shifman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-labeling+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+analysis+of+overlapping+gene+expression+in+brain+tissue+with+high+level+of+autofluorescence.">Triple-labeling whole-mount in situ hybridization method for analysis of overlapping gene expression in brain tissue with high level of autofluorescence.</a> J Cytol Histol. , S3-S011 (2015).</li><li>Murdoch, A., Jenkinson, E. J., Johnson, G. D., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase-fast+red,+a+new+fluorescent+label.+Application+in+double+labelling+for+cell+cycle+analysis.">Alkaline phosphatase-fast red, a new fluorescent label. Application in double labelling for cell cycle analysis.</a> J Immunol Methods. 132 (1), 45-49 (1990).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+alkaline+phosphatase-mediated+azo+dye+staining+for+dual+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish.">Application of alkaline phosphatase-mediated azo dye staining for dual fluorescent in situ hybridization in zebrafish.</a> Neuromethods. 99, In situ hybridization methods, 393-404 (2015).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, 43 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

В гибридизация (выход) с радиоактивно меченых зондов нуклеиновых кислот часто используется для определения локализации РНК на срезах тканей. Метод радиоактивных ISH, однако, требует много времени, менее чувствительны, и не позволяют признательность полных схем распределения стенограмма в целом-крепления. В противоположность этому, в настоящем документе метод описано МС-WISH позволяет непосредственное сравнение нескольких доменов экспрессии генов в контрастные цвета в интактных эмбрионов. МС-ЖЕЛАНИЕ имеет то преимущество, что гистологическое контексте сразу видно, и визуализировать просто стандартный светлого микроскопии. Это обеспечивает возможность связать экспрессии генов домены топографически друг к другу с высокой точностью и определить уникальные и перекрывающиеся участки выражение в быстрой и надежным способом. С другой стороны, мультиплексированный флуоресцентные ISH (FISH) является более мощным по отношению к чувствительности и разрешения и предпочтительно используется, если сотовой или даже субклеточном повторноРешение обнаружения мРНК требуется. Широкий спектр транскриптов, что был картирован на MC-WISH предполагает, что практически любой транскрипт могут быть проанализированы не только в эмбриональных но также и в личиночной и тканей взрослого и в других, чем Drosophila видов. Действительно, описанная процедура подробно здесь дрозофилы, работает аналогично эффективным с эмбрионов данио 11,16,22. Кроме того, способ МС-WISH может быть адаптирована к широкому кругу беспозвоночных и позвоночных эмбрионов и образца ткани. Гаптен- этикетки и концентрации зонда Мы регулярно использовать флуоресцеин, дигоксигенином, и биотин, как гаптен этикетках РНК-зондов. Кроме того, динитрофенол-меченых зондов могут быть применены, который были введены в данио WISH экспериментов 23-25. Меченных флуоресцеином зонды отображения меньшую чувствительность по сравнению с другими гаптен-меток, так что флуоресцеин лучше всего использовать Fили обнаружение обильных транскриптов. Каждый вновь переписана зонд впервые опробован в одном ПОЖЕЛАНИЙ эксперимента, где его производительность оценивается либо с помощью BCIP / NBT или Fast красный в качестве субстрата. Концентрация зонда считается оптимальным, когда сильный сигнал без развития фона достигается в течение нескольких минут, чтобы ч. Чтобы убедиться, что домены экспрессии интерес были обнаружены в их полном объеме по MC-желание, важно, чтобы визуализировать каждый транскрипт шаблон по одной метки экспериментов с использованием WISH наиболее чувствительный сочетание подложки, BCIP / NBT. Это гарантирует, что слабые домены экспрессии не забывают в нескольких целевой эксперимента в. Чтобы компенсировать меньшей чувствительности других комбинаций субстрата это необходимо использовать в два раза (три раза), чтобы концентрации зонда по сравнению со стандартными BCIP / NBT окрашивания. Низкая инактивация рН Инактивация шаг с низким рН может привести кчастичная дезинтеграция антисмысловых гаптен-меченой РНК зонд / чувство мРНК гибридов приводит к снижению обнаружения сигнала в втором и третьем раундах окрашивания. Чтобы свести к минимуму потерю чувствительности, шаги инактивации как можно короче. Мы испытали, что в 10 мин времени инкубации при низких рН является достаточным для ликвидации AP-деятельности. Последующие быстро смывает в больших объемах обеспечить быстрое разбавление несвязанных конъюгатов антитело-AP и предотвратить повторное связывание с haptenized зондов. Альтернативные процедуры включают параформальдегид фиксации и тепла инактивации. Тем не менее, некоторые из цветных выделений не термостабильной и фиксацией параформальдегидом не может быть достаточно для полной инактивации AP. Неполное инактивации первого прикладного антитело-AP, сопряженных может привести к повторной визуализации мРНК шаблона в следующий раунд обнаружения приводит к ложных срабатываний перекрытия в выражении с второго вида мРНК для обнаружения. Таким образом, в контрольном эксперименте йе эмбрионы разделить на две фракции после инактивации первого прикладного антитело-AP конъюгата. Второе антитело-AP конъюгат исключены из фракции управления и не должны формировать сигнал во второй цветной реакции. Тем не менее, если второе цветной реакции генерирует сигнал распределения рисунок, соответствующий первому, то процедура инактивации была неэффективной. В этом случае время инкубации в низком рН раствора остановки должны быть пролонгирован на следующий эксперимент. Заказы А.П. применения подложки Так чувствительность падает с каждым последующим тура обнаружения, желательно, чтобы обнаружить в меньшем количестве мРНК до более обильными транскриптов. Кроме того, быстрый красный и синий Быстрые комбинации субстрата значительно менее чувствительны, чем purpleblue BCIP / NBT пятна, так что быстро красители предпочтительно наносят в первом раунде окрашивания для обнаружения сильного выраженной транскрипта. Это также чкак преимущество, что после BCIP / НБТ окрашивание можно контролировать и вовремя остановился, прежде чем сигнал purpleblue становится слишком темно в отношении легких быстрых красителей. Таким образом, в стандартной двухцветной эксперимента, сначала, тем сильнее выражена мРНК обнаруживается Fast Red и второй более слабый по BCIP / НБТ. В качестве альтернативы быстрого красителей желтые комбинации INT подложки могут быть применены, которые, однако, производят осадков, которые становятся диффундируют через некоторое время. Поэтому BCIP / INT исключительно применяются в последнем туре окрашивания. Следовательно, в три цвета эксперимента в мы часто сначала использовать быстрый Red, второго BCIP / НБТ (или быстрый синий) и третий комбинацию подложки INT. Обратите внимание, что желательно, чтобы сфотографировать окрашенных эмбрионов как можно скорее при применении INT. Флуоресцентные обнаружения азокрасителей Это может быть иногда трудно распознать пересекающиеся паттерны экспрессии, когда темный цвет осадок слежка более легкое. Fили, например, сильно развита BCIP / НБТ осадок может маскировать легкие сигналы Быстрая краска. Один из способов обойти эту проблему, чтобы сразу захватить изображения после каждого окрашивания и удалить нанесенный цветной осадок до следующего раунда обнаружения. В этом случае спирте азокрасителя (Fast Red) и INT осадки удаляют этанол промывок после первого и второго раундов обнаружения, соответственно, и окрашивание BCIP / NBT применяется в качестве последнего AP-подложки 26. Другая возможность состоит в использовании флуоресцентных свойств азокрасителей. Быстрый Красный могут быть визуализированы с помощью родамина фильтр устанавливает 27, в то время быстрого Синий можно наблюдать далеко красных фильтров 28,29. Сравнение или наложение хромогенными и флуоресцентных изображений может выявить сайт совместного distribution.Using этот подход, развитие BCIP / НБТ сигнал должен быть остановлен во времени, так что это не станет слишком плотным и утолить флуоресцентный сигнал азокрасителя Продукт реакции.

В гибридизация (ISH) является стандартным методом для обнаружения и локализации РНК-транскриптов в морфологической контексте, в клетках, тканях и организмах 1. Сигналы, полученные в соответствии с процедурой ISH обычно визуализируется радиоактивных, люминесцентных и пигментных систем обнаружения. В последние годы значительные технологические достижения в люминесцентной ISH (FISH) 2 привело к резко улучшить чувствительность и разрешение, что позволяет обнаружения и количественного выражения РНК в одной ячейки и суб-клеточном уровнях и РНК визуализации до единичных молекул 3,4 .while изощренные методы одиночных молекул FISH используются для более специализированных приложений, Хромогенный ISH широко распространена в качестве рутинной РНК в месте обнаружения метода в исследования и клинической диагностики. Для хромогенным обнаружения фермента реакции осаждения используются, которые генерируют видимые продукты в контрастные цвета на сайтахгибридизации 5. Это имеет то преимущество, что РНК визуализации могут быть объединены с обычными гистологическими пятен и морфологической контексте сразу видно, с помощью стандартной светлого микроскопии. Кроме того, многочисленные применяемых цветовых подложках произвести осадок, которые стабильны в органических и / или водных средах монтажных, так что постоянные препараты образец может быть получен 5. В дрозофилы, начальные протоколы ISH применяется радиоизотопных меченых зондов для обнаружения стенограммы на секционного материала 6. Хотя это трудно восстановить из срезов тканей полная расшифровка моделей целых эмбрионов или системы органов, применение хромогенных процедур ISH с не радиоактивно меченых зондов делает возможным обнаружение распределения глобально РНК в цельной крепления 7. Хотя многие вариации хромогенным ISH существует, в типичных вся монтажа в гибридизация (желанию) протоколы Hybridized гаптен-меченых зондов обнаруживаются анти-гаптен антител, конъюгированных с ферментом-репортером и транскрипты мРНК визуализируются осаждающего хромогена. Палитра разноцветных осадков, производимых ферментов-репортеров щелочную фосфатазу (AP), пероксидазу хрена (POD) и бета-галактозидазы (GAL) учитывает отличительные детектирования нескольких мишеней в одном и том же образце 8-14. Тем не менее, POD ферментативная активность длится только в течение ограниченного периода времени и GAL колориметрический реакция несколько менее чувствительны, так что без дополнительного (tyramide) усиление сигнала 15 обнаружения менее обильными стенограммы может быть сложным с этими ферментами. В отличие от этого, непреходящая деятельность AP позволяет для длительного оборота подложки и высоким соотношением сигнал-шум. Таким образом, последовательное обнаружение с помощью фермента-репортера AP с разноцветных подложек оказался успешным в обеспечении эффективного иОтличительной обнаружение до трех различных транскриптов в единичных эмбрионов 10-12,16. Для этого мульти-целевой хромогенным WISH (МС-желанию) метода (рис 1) 14, меченые антисмысловые РНК-зонды порождаются в пробирке транскрипции и отмечены в одной из доступных гаптен- этикеток. Эмбрионы формальдегида фиксированной и проницаемыми путем обработки метанолом и протеиназы К пищеварения. Гибридизация эмбрионов одновременно осуществляется до трех разному маркированных антисмысловой РНК зондов, специфичных для каждого другого гена. После удаления несвязанного зонда по жесткости моет каждый гаптен-лейбл визуализируется в отдельном раунде обнаружения. Один раунд обнаружения состоит из инкубации эмбрионов с анти-гаптен антитела, связанного с АП и РНК визуализации путем приложения AP-субстрат, который производит локализованную стабильную цветовую осадок. После обнаружения антител и окрашивания, приложенное антитело-AP conjuВорота удаляют мытье низкой рН. В многоцветных экспериментов, каждый виток обнаружения использует антитело направлено против другого гаптена метки, и каждый образец транскрипт визуализировали другого цвета подложки (таблица 1). Эмбрионы установлены в глицерине и отображаемого под сложный микроскоп высокого разрешения с использованием дифференциального интерференционного контраста (DIC) оптики.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Deionized, diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0603</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T7 RNA Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EP0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T3 RNA Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EP0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SP6 RNA Polymerase&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EP0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RiboLock RNase Inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNase I, RNase-free&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NTP Set</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digoxigenin-11-UTP</td>
			<td style="width:83px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11209256910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescein-12-UTP</td>
			<td style="width:83px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11427857910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biotin-16-UTP</td>
			<td style="width:83px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11388908910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:83px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A2936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol, absolute&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">di-Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:83px;">Scharlau</td>
			<td style="width:119px;">SO0339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:83px;">Scharlau</td>
			<td style="width:119px;">SO0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrochloric acid&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:119px;">100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tri-Sodium citrate</td>
			<td style="width:83px;">Scharlau</td>
			<td style="width:119px;">SO0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">deionized formamide</td>
			<td style="width:83px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A2156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNA type VI from torula yeast</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:83px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sheep serum</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sheep anti-biotin-AP Fab fragments&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11426303001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sheep anti-digoxigenin-alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td>
			<td style="width:83px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sheep anti-fluorescein-AP Fab fragments</td>
			<td style="width:83px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11426303001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Rabbit anti-dinitrophenyl-AP antibody</td>
			<td style="width:83px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">MB-3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:83px;">Scharlau</td>
			<td style="width:119px;">TR04241000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:83px;">Scharlau</td>
			<td style="width:119px;">MA0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:83px;">Scharlau</td>
			<td style="width:119px;">SO0227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:83px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fast Red tablet set</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fast Blue BB salt</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Naphthol-AS-MX-phosphate</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Naphthol-AS-GR-phosphate</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N3625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Naphthol-AS-BI-phosphate</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N2250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magenta-Phos</td>
			<td style="width:83px;">Biosynth</td>
			<td style="width:119px;">B7550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">INT</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NBT</td>
			<td style="width:83px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BCIP</td>
			<td style="width:83px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">INT/BCIP solution</td>
			<td style="width:83px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11681460001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol 86-88%</td>
			<td style="width:83px;">Scharlau</td>
			<td style="width:119px;">GL0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Universal incubator</td>
			<td style="width:83px;">Memmert</td>
			<td style="width:119px;">BE400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Waterbath</td>
			<td style="width:83px;">Memmert</td>
			<td style="width:119px;">WB14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heat block</td>
			<td style="width:83px;">Grant</td>
			<td style="width:119px;">QBT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Netwell&#160; inserts 15 mm</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Netwell carrier kit 15 mm</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">12-well cell culture plate</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:119px;">83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 ml microtube</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.0 ml microtube</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:119px;">72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization for comparing gene expression domains in drosophila embryos

Для анализа генов регуляторных сетей активные во время эмбрионального развития и органогенеза, что имеет важное значение для точного определения того, как различные гены экспрессируются в пространственном отношении друг к другу на месте. Мульти-целевой Хромогенный вся монтажа в гибридизация (MC-желанию) значительно облегчает мгновенное сравнение паттернов экспрессии генов, так как она позволяет отличительный визуализации различных видов мРНК в контрастные цвета в том же образце пробы. Это обеспечивает возможность связать экспрессии генов домены топографически друг к другу с высокой точностью и определить уникальные и перекрывающиеся участки экспрессии. В представленном протоколе мы опишем процедуру MC-Wish для сравнения мРНК из структур различных генов в эмбрионах дрозофилы. До трех РНК-зондов, каждый конкретный другого гена и помечены другим гаптена, одновременно гибридизации с образцами зародышей и впоследствии обнаружены щелочипе фосфатазы основе колориметрического иммуногистохимии. Описанная процедура подробно здесь дрозофилы, но одинаково хорошо работает с эмбрионами данио.

Описанный протокол позволяет одновременно визуализации нескольких шаблонов транскриптов в различных цветах. МС-WISH обеспечивает преимущество непосредственно сравнить характер экспрессии различных генов в той же эмбриона. В качестве примера, паттерны экспрессии пустых дыхальца (EMS) 19 Fushi tarazu (ЗСТ) 20 и неряшливо паре 1 (SLP1) 21 непосредственно сравниваются дрозофилы бластодермы стадии эмбрионов и визуализированы в различных цветовых оттенков (Рисунок 4) , Различные комбинации AP подложки можно получить панель контрастного цвета осадок (Таблица 1). Красный цвет осадок от быстрых красный и фиолетовый осадка, полученного по BCIP / НБТ может быть легко отличить и поэтому используются наиболее распространеннымLY в двухцветных экспериментов (4А). Тем не менее, пятно BCIP / НБТ может быстро превратиться в довольно темного цвета, так что быстрого Красный цвет маскируется в случае частичной совместном распространении транскриптов. Таким образом, применение Fast синий может быть преимуществом, которое генерирует синий, зеленый и фиолетовый продукты в сочетании с NAMP, NAGP и NABP, соответственно (таблица 1). Сочетание быстрого синий с NAMP дает светло-голубой цвет, который легко различимы от Fast Red продукта в соседних или перекрывающихся областей экспрессии, как показано здесь EMS и SLP1 сайтов экспрессии визуализированных в красный и синий, соответственно (рис 4б). Быстрое сочетание Голубой NAGP обеспечивает аналогичный сильный контраст с быстрым красное пятно, так что зеленый домена EMS явно отличительные от сайта красного SLP1 экспрессии (фиг.4С). Тем не менее, если EMS и SLP1 сайты экспрессии денал, Fast Голубой NABP и Fast Red, соответственно, в результате фиолетовый и красный цвет осадки менее заметны (рис 4D). Как уже упоминалось выше, быстрого Красный и Синий Быстрая NAGP легко отличить, как показано SLP1 и ЗСТ выражения в красный и зеленый, соответственно (рис 4D). MagentaPhos в сочетании с INT производит желтый осадок, который используется, чтобы показать сегментную экспрессию СТЗ (фиг.4С, Е). Желтый цвет осадок и генерирует хороший контраст с синего цвета подложки, как на примере обнаружения SLP1 и ЗСТ с Fast Голубой NAMP и MAG / INT, соответственно (рис 4E). Тем не менее, желтый осадок легко различимы менее от быстрого Red продукта. Желтый домена окрашенных выражение EMS может быть чуть Дисти<html> nguished от ростральной экспрессии SLP1 показано в красном (рис 4F). Таким образом, сочетание цветных подложек должен быть тщательно подобраны для каждого эксперимента. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig1.jpg" /> Рисунок 1. Блок-схема MC-Wish. Для многоцветной визуализации из трех уникальных моделей стенограммы, выбирать между различными конъюгатов антитело-AP и комбинаций цвета подложки в каждом цикле обнаружения. Сокращения: AP, щелочной фосфатазы; БИО, биотин; DIG, дигоксигенин; FLUO, флуоресцеина. Для других сокращений см легенды Рисунок 4 и таблица 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> S / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg &quot;/&gt; Рисунок 2. Вставки в качестве носителей эмбриона. (A) Вставки установлены внизу с полиэфирных мембран диаметром 15 мм и 74 мкм размер сетки используются в качестве носителей дрозофилы эмбрионов. (Б) вставки собраны в 12-луночных планшетах, которые функционируют как резервуара лотков для различных решений. (C) Доступные носители и ручки позволяют обработку (D) 12 проб / сэмплов эмбрион одновременно. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig3.jpg" /> Рисунок 3. Установка окрашенных эмбрионов. Эмбрионы установлены в капле 70% глицерина между двумя пакетами покровные, которые функционируют как распорки. Нежный перемещение приложениялгал большой покровное помогает вращать установленные эмбрионов в нужной ориентации для наблюдения и фотографирования. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig4.jpg" /> Рисунок 4. Многоцветный визуализация мРНК-транскриптов в эмбрионах дрозофилы. Примеры МС-WISH экспериментов в эмбрионах дрозофилы показано с боковым видом на. Паттерны экспрессии мРНК пустых дыхальца (EMS), Fushi tarazu (ЗСТ) и небрежно парные 1 (SLP1) визуализируются различных комбинаций субстрата цвета AP, которые указаны на каждой панели. Стенограммы были обнаружены (A) ЗСТ Fluo и EMS DIG, ( <stroнг&gt; B) SLP1 Fluo, EMS BIO и ЗСТ DIG, (C) EMS BIO, SLP1 FLUO и ЗСТ DIG (D) ЗСТ BIO, SLP1 FLUO, и EMS DIG, (E) SLP1 Fluo, EMS DIG, и ЗСТ БИО (F), ЗСТ БИО, SLP1 Fluo, и EMS DIG меченых зондов. Гаптен-меченых зондов были обнаружены иммуногистохимически один за другим в перечисленных заказов. Сокращения: FB быстрого Синие; FR, быстрая Красный таблетки. Для других сокращений см легенды Рисунок 1 и Таблицу 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Сочетание основания </td><td> Добавить 1 мл буфера А. П. </td><td> Concentraции [мкг / мл] </td><td> AP буфер </td><td> цвет </td><td> Чувствительность сигнала </td></tr><tr><td> BCIP НБТ </td><td> 3,5 мкл 4,5 мкл </td><td> 175 337,5 </td><td> SB9.5 </td><td> пурпурный </td><td> +++ </td></tr><tr><td> МАГ INT </td><td> 5 мкл 5 мкл </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> желтый </td><td> + </td></tr><tr><td> BCIP / INT раствор </td><td> 7.5 мкл </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td> желтый </td><td> + </td></tr><tr><td> Быстрый Голубой NAMP </td><td> 5 мкл 5 мкл </td><td> 250 250 </td><td> SB8.2 </td><td> синий </td><td> ++ </td></tr><tr><td> Быстрый Голубой NABP </td><td> 20 мкл 10 мкл </td><td> 1000 500 </td><td> SB8.2 </td><td> Фиолетовый </td><td> ++ </td></tr><tr><td> Быстрый Голубой NAGP </td><td> 10 мкл 10 мкл </td><td> 500 500 </td><td> TT8.2 </td><td> зеленый </td><td> + </td></tr><tr><td> Быстрый Красный NAMP </td><td> 1 таблетка </td><td> 1000 400 </td><td> TT8.2 </td><td> красный </td><td> ++ </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Комбинации подложки Сокращения: +++, сильный;. ++ Среднего; +, Слабый НБТ, хлорид 4-нитро-синего тетразолия-; BCIP, 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат; INT, 2- (4-иодфенил) -3- (4-нитрофенил) -5-фенил-тетразолия хлорида; МАГ, пурпурный-Фос, 5-бром-6-хлор-3-индолил-фосфат, NAMP, нафтол-AS-MX-фосфат; NABP, Нафтол-АС-БИ-фосфат; NAGP, Нафтол-АС-GR-фосфат; SB9.5, окрашивание буфера при рН 9,5; SB8.2, окрашивание буфере при рН 8,2; TT8.2, трис-Tween буфере при рН 8,2.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos at JoVE.com

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Мы опишем весь Mount-гибридизация процедуру мульти-целевой хромогенную (MC-желанию) в интактных эмбрионов дрозофилы, позволяющих одновременно и конкретное обнаружение трех различных моделей распределения мРНК путем контрастных цветовых выделений.

Мульти-целевой Хромогенный Всего монтажа<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация для сравнения экспрессии генов доменов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Понимание начале Органогенез, используя упрощенную<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация Протокола в<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

В визуализации in vivo трансгенной экспрессии генов в Персональной Ретинального прародителей в химерных эмбрионов данио рерио по изучению мобильных неавтономных Влияния

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Визуализация Multiciliated клетки в Zebrafish через комбинированные протокола вся гора флуоресцентные в Situ Гибридизация и иммунофлуоресценции

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Трассировка экспрессии генов путем обнаружения активности β-галактозидазы в целом мыши эмбрионов

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount в гибридизации Situ Астианакт эмбрионов

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Генотипирование и количественная оценка в Ситу Гибридизации Окрашивание в зебрафиш

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Целая гора В Ситу Гибридизация в зебрафиш эмбрионов и трубоусветки Ассав в iPSC-ECs для изучения роли эндоглин в сосудистом развитии

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Целая гора иммуногистохимия в зебрафиш эмбрионов и ларьков

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...