Name: the development of lyophilized loop-mediated isothermal amplification reagents for the detection of coxiella burnetii
Uploaded: 2016-04-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Naval Medical Research Center, forskningsarbeid enhet 6000.RAD1.J.A0310. Synspunktene i denne artikkelen er de av forfatterne, og reflekterer ikke nødvendigvis den offisielle politikk eller plasseringen av Department of the Navy, Department of Defense, eller den amerikanske regjeringen. Wei-Mei Ching er en ansatt av den amerikanske regjeringen. Dette arbeidet ble utarbeidet som en del av hennes offisielle plikter. Tittel 17 USC §105 fastsetter at &quot;Copyright beskyttelse under denne tittelen er ikke tilgjengelig for noe arbeid av myndighetene i USA. Tittel 17 USC §101 definerer en amerikansk regjering arbeid som arbeid utarbeidet av militærtjeneste medlem eller ansatt av den amerikanske regjeringen som en del av vedkommendes tjenesteplikter.

1. Forbered plasmid DNA fortynninger som standard for LAMP Reaction <ol><li> Bruke et spektrofotometer for å måle den optiske tetthet (OD) ved 260 nm for å bestemme plasmidet (inneholdende target-genet IS1111a av C. burnetii RSA 493) DNA-konsentrasjon. En OD 260 på 1 tilsvarer 50 ug / ul av DNA. </li><li> Konverter mengden av plasmid-DNA inn i kopiantall. Siden størrelsen på plasmidet er 6330 bp, molekylvekten av dette plasmid er 4,1 x 10 6 g (6330 bp x 649 g / bp). DNA-ko...

<ol>
	<li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States,+2013:+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group.">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li><li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis.">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li><li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li><li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li><li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia.">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li><li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification.">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li><li>Huber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+targeting+the+47-kDa+gene+of+Orientia+tsutsugamushi.:+A+rapid+and+sensitive+alternative+to+real-time+PCR.">Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR.</a> J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).</li><li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li><li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation.">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li><li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores.">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+(LAMP)+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates.">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li><li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii.">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria.">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li></ol>

Tidligere har vi utviklet en sensitiv og spesifikk LAMP analyse rettet mot innsetting element IS1111a 14. Den IS1111 element ble valgt fordi det er sterkt konservert blant de ulike stammer av C. burnetii og sitt høye antall kopier (7-110) i bakterier (Klee 2006). Våre resultater viste at lampen kan detektere omtrent 25 kopier av IS1111 element, som kan relateres til så lite som en kromosomal kopi av Coxiella DNA. I denne studien ble Bst DNA polymerase, ...

Den lille Gram-negative bakterien Coxiella burnetii er den utløsende agent for Q-feber, som er et verdensomspennende zoonose. På grunn av Q-feber verdensomspennende distribusjon og høy smittsomhet av C. burnetii, amerikanske militære og sivilt personell utplassert i utlandet står i fare for å bli smittet i endemiske områder. Q-feber manifesterer seg i to former: akutte og kroniske infeksjoner. Akutt Q-feber presenterer seg med influensalignende symptomer, hepatitt eller lungebetennelse, og er vanligvis en selvbegrensende sykdom med lav dødelighet. Kronisk Q-feber, mens mindre utbredt, ofte resulterer i endokarditt, som har en mye høyere dødelighet hvis venstre ubehandlet 1,2. Derfor, for å tidlig diagnose lede en passende behandling er avgjørende for pasientbehandlingen. Polymerase kjedereaksjon (PCR) og kvantitativ sanntid PCR (qPCR) analyser er blitt utviklet for påvisning av C. burnetii DNA i cellekulturer og kliniske prøver 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Både PCR og qPCR er kostbare og ofte ikke lett tilgjengelig i ressursbegrensede områder for rutinearbeid. Sløyfe-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) opprinnelig beskrevet av Notomi 6, og tilbyr en alternativ DNA forsterkning metoden. LAMP bruker Bst DNA polymerase for tråd forskyvning DNA-syntese sammen med spesialdesignede primersett som gjenkjenner minst seks selvstendige regioner av målet genet. Den største fordelen av LAMP er at forsterkningen skjer under isotermiske forhold. Derfor er bare et vannbad, varmeblokk eller en inkubator nødvendig. Denne metoden har blitt anvendt for å detektere flere rickettsial patogener 7-9. Visualisering av amplifiserte DNA-produkter ved gelelektroforese er den mest nøyaktige metode som kan skille sanne positive fra falske positive på grunn av ikke-spesifikk amplifikasjon. Men de prosedyrer involvert i gel elektroforese er ikke praktisk for ressursbegrenset arEAS. Flere alternative fremgangsmåter ble utviklet for å detektere reaksjonsproduktene. Disse alternative, for eksempel turbiditet avledet fra magnesium pyrofosfat formasjonen 10 eller ved hjelp av en fluorescerende interkalerende fargestoff for å bli visualisert under UV-lys 11,12 er mer gunstig enn å kjøre en gel. LAMP- reagensene var stabile i en måned når det lagres ved 25 ° C og 37 ° C, som er omgivelsestemperaturer i tropiske og subtropiske land hvor Q-feber er endemisk 13. En lampe assay ble utviklet i vårt laboratorium for å påvise nærvær av C. burnetii i plasmaprøver 14. Her beskriver vi en enkel protokoll for fremstilling av lampen reaksjonsblandingen fra de lyofiliserte reagenser. De lyofiliserte reagenser er stabile i en måned når det lagres ved romtemperatur. Når det kombineres med en enkel visualisering metode, er dette en ideell metode å bruke for å påvise C. burnetii i en ressursbegrenset setting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">LAMP primers</td>
			<td style="width:188px;">Eurofins MWG operon</td>
			<td style="width:131px;">10 nmol, salt free</td>
			<td style="width:240px;">Sequence designed by customer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">Bst DNA polymerase</td>
			<td style="width:188px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">M0275L</td>
			<td style="width:240px;">8 units/ml</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">10X Thermo pol buffer</td>
			<td style="width:188px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">B9004S</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">dNTP mixture</td>
			<td style="width:188px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">N0447L</td>
			<td style="width:240px;">10 mM each</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">Betaine</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">B0300</td>
			<td style="width:240px;">5 M, Trimethylglycine</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M3409-1ML</td>
			<td style="width:240px;">1 M</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">10X Bluejuice</td>
			<td style="width:188px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">10816-015</td>
			<td style="width:240px;">gel loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">SYBR green</td>
			<td style="width:188px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">S7585</td>
			<td style="width:240px;">10,000X, visualize products in tubes</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">GelRed</td>
			<td style="width:188px;">Phenix Research Products</td>
			<td style="width:131px;">RGB-4103</td>
			<td style="width:240px;">10,000X, visualize products in gels</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">Lyophilized reagents</td>
			<td style="width:188px;">Gene Reach</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">Hydroxynaphthol blue</td>
			<td style="width:188px;">Fluka</td>
			<td style="width:131px;">33936-10G</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:215px;">ESEQuant tube scanner</td>
			<td style="width:188px;">Qiagen</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:240px;">real-time detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development of lyophilized loop-mediated isothermal amplification reagents for the detection of coxiella burnetii

Coxiella burnetii, agenten forårsaker Q-feber er en obligat intracellulær bakterie. PCR-baserte diagnostiske analyser er blitt utviklet for påvisning av C. burnetii DNA i cellekulturer og kliniske prøver. PCR krever spesialisert utstyr og omfattende opplæring av sluttbruker, og derfor er det ikke egnet for rutinearbeid, spesielt i en ressurs med begrenset område. Vi har utviklet en sløyfe-mediert isoterm amplifisering (lampe) assay for å påvise nærværet av C. burnetii i pasientprøver. Denne fremgangsmåten utføres ved en enkelt temperatur rundt 60 ° C i et vannbad eller varmeblokk. Følsomheten av denne lampen analysen er svært lik PCR med en deteksjonsgrense på ca. 25 kopier pr reaksjon. Denne rapporten beskriver fremstillingen av reaksjonen ved bruk av lyofiliserte reagenser og visualisering av resultater ved hjelp av hydroxynaphthol blå (HNB) eller en UV-lampe med fluorescerende interkalerende fargestoff i reaksjonen. LAMP reagenser var lyophilized og lagret ved romtemperatur (RT) i en måned uten tap av følsomhet. Dette LAMP analysen er spesielt robust fordi reaksjonsblandingen preparatet ikke involverer kompliserte trinn. Denne metoden er ideell for bruk i ressursbegrensede miljøer hvor Q-feber er endemisk.

De frysetørrede LAMP reagenser inne i 0,2 ml tube inneholder Bst DNA polymerase, primere, og dNTP. 20 ul rekonstitusjonsbuffer brukes til å re-suspendere de lyofiliserte reagenser. Figur 1 viser LAMP reaksjons resultatene på agarosegel med nylagde reagenser og lyofiliserte reagenser. Det lyofiliserte reagens ikke redusere sin aktivitet. LAMPE reaksjoner fremstilt av begge reagenser kan detektere 25 kopier av DNA-templat. Figur 2 viser påvisn...

Watch this Scientific Journal Video about The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii at JoVE.com

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvikling av lyofilisert Loop-mediert Isotermiske amplifiseringsreagenser for deteksjon av<em&gt; Coxiella burnetii</em

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generasjon av rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkjente Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Vurdere utvikling av Murint Plasmacytoid dendrittiske celler i Peyer sin Patches Bruke Adoptive Overføring av Hematopoietic stamfedre

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse av MyD88-mediert cellulær immunrespons til West Nile Virus Mutant Strain Infeksjon

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcÃƒÅ½Ã‚ÂµRI

Utvikling av en<em&gt; In vitro</em&gt; Modellsystem for å studere samspillet mellom<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE med sin high-affinitetsreseptor FceRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediert Isotermisk forsterkning (LAMP) Analyser for Artenes spesifikke Påvisning av<em&gt; Eimeria</em&gt; Som infiserer Kyllinger

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative analyser for påvisning og karakterisering av Protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Bruk av Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) for å undersøke Effector Trans Effektivitet av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA lyddemping

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Utvikling av en mer sensitiv og spesifikk kromogen Agar Medium for deteksjon av<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Og annet<em&gt; Vibrio</em&gt; Arter

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Utvikling og identifikasjon av en Novel undergruppe av menneskelige nøytrofilmedierte avledet Giant Fagocytter<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...