Name: amplification, next-generation sequencing, and genomic dna mapping of retroviral integration sites
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites at JoVE.com

ونحن ممتنون لزملائنا ستيفن هيوز وهنري ليفين للحصول على المشورة التي كانت حاسمة لوضع بروتوكول NGS للفيروسات موقع التكامل التسلسل في المختبر Engelman. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة منح AI039394 وAI052014 (لمتفجرات نترات الأمونيوم) وAI060354 (مركز جامعة هارفارد للأبحاث الإيدز).

1. توليد مخزونات فيروس ملاحظة: وصفت مخطط تدفق الجانب مقاعد البدلاء الرطب من هذا البروتوكول في الشكل 1 وتفاصيل إنتاج الأسهم الفيروسية والعدوى لاحق من خلايا نسيج الثقافة ينطبق عموما على أنواع مختلفة من الفيروسات. بالنسبة لب...

بروتوكول لتحليل مواقع التكامل فيروسات، من الخطوة عدوى فيروس الأولية من خلال رسم خرائط لأنماط توزيع الجينومية، وصفت. هذا البروتوكول ينطبق على أي الارتجاعي وأي نوع من الخلايا مصابة. وعلاوة على ذلك، فإن خط الأنابيب فحص حساس جدا، مع القدرة على استعادة عدد كاف من مواقع ا?...

دمج الحمض النووي الفيروسي (vDNA) في الجينوم الخلية المضيفة خطوة أساسية في دورة حياة فيروس. ويتم إنجاز التكامل من إنزيم مدمج الإنزيم الفيروسي (IN)، التي تنفذ عمليتين الحفازة متميزة تؤدي إلى إنشاء طليعة الفيروس إدراج مستقر 1. في مفارز إشراك طرفي vDNA الخطية التي يتم إنشاؤها من خلال النسخ العكسي، وتشكيل intasome العليا مع vDNA ينتهي عقد معا من قبل في متعدد القسيمات 2-4. في يشق &#39;ينتهي من vDNA المصب من 5&#39;-CA-3 ثابتة &quot;3 تسلسل في عملية تعرف باسم 3&#39;معالجة تاركة راحة 3&quot; ينتهي مع مجموعة الهيدروكسيل على رد الفعل في كل vDNA النهاية 5-8. يتم استيراد intasome في وقت لاحق الى نواة كجزء من التجمع كبيرة من المضيف والبروتينات الفيروسية المعروفة باسم مجمع preintegration (PIC) 9-11. بعد أن واجهت الهدف الخلوي الحمض النووي (tDNA)، يستخدم في vDNA 3&#39;-الهيدروكسيل غروشكا ليلتصق الجزء العلوي tDNA وخيوط أسفل بطريقة متداخلة في وقت واحد ينضم إلى vDNA للمجموعات الفوسفات tDNA 5 &quot;خلال عملية نقل حبلا 12،13. الفيروسات القهقرية تفضيلات المواقع التكامل المعرض على المستويين المحلي والعالمي. محليا، مواقع التكامل إجماع تتكون من تسلسل tDNA المتناوب الحفاظ ضعيفة التي تمتد من حوالي 5-10 سنة مضت المنبع والمصب من المواقع الإدراج vDNA 14،15. وعلى الصعيد العالمي، الفيروسات تستهدف الشروح لونين محددة 16. هناك سبعة أجناس فيروسات مختلفة - ألفا خلال إبسيلون، lenti، وspuma. وlentiviruses، والتي تشمل HIV-1، لصالح التكامل داخل الهيئات الجينات كتب بنشاط 17، في حين أن gammaretroviruses دمج تفضيلي إلى المواقع النسخي بداية (TSSs) والمناطق محسن النشطة 18-20. في تناقض حاد، منحازة بقوة spumavirus نحو heterochromالمناطق آتيك، مثل المجالات المرتبطة الصفيحة الفقراء الجينات 21. تفضيلات قاعدة tDNA المحلية هي في جزء كبير منه تمليه شبكات معينة من أسماء البروتين النووي بين في وtDNA 13،22،23. لlentiviruses وgammaretroviruses، والتكامل بالنسبة لشروح الجينوم هو في جزء كبير تحكمه التفاعلات بين في والعوامل الخلوية وما شابه 24-27. تغيير تفاصيل شبكة التفاعل IN-tDNA 13،22،23،28 وتعطيل أو إعادة الهندسة في استضافة التفاعلات عامل 25-27،29-32 ثبت استراتيجيات لإعادة التوجيه التكامل على المستويين المحلي والعالمي، على التوالي. وزادت قوة الإجراءات تسلسل الحمض النووي يستخدم لفهرسة مواقع التكامل فيروسات بشكل كبير على مدى العقود الماضية. تم انتشال المواقع التكامل في العمل الرائد باستخدام تنقية شاقة وتقنيات الاستنساخ اليدوية لانتاج عدد قليل من المواقع الفريدة في 33،34 الدراسة.الجمع بين LM-PCR التضخيم من تقاطعات الحمض النووي LTR المضيفة مع القدرة على الخريطة مواقع التكامل الفردية لجينوم مشروع الماوس الإنسان وتحول الميدان، مع عدد من المواقع تعافى من الإصابة خلية زراعة الأنسجة الخارجية المتزايدة إلى عدة مئات إلى آلاف 17 18. وقد ارسلت مزيج أحدث من LM-PCR مع منهجية خ ع ​​عمق مكتبة تقفز. على وجه التحديد، أسفرت سلسلة البايرو بناء على أمر من عشرات الآلاف من المواقع التكامل فريدة 30،35-38، في حين المكتبات التسلسل من خلال استخدام تجميع الحمض النووي يمكن أن تسفر الملايين من تسلسل فريد 19-21،39. نحن هنا وصف بروتوكول LM-PCR الأمثل لتضخيم وتسلسل مواقع التكامل فيروسات باستخدام خ ع الحمض النووي المجموعات. طريقة يدمج يتطلب تسلسل محول الى الاشعال PCR، وبالتالي مباشرة إلى جزيئات تضخيم الحمض النووي، مما يحول دون الحاجة إلى خطوة إضافية محول ربط قبل sequenالوراثة 40. خط أنابيب تحليل بيوينفورمتيك، من إعراب تسلسل البيانات الخام للتقاطعات الحمض النووي LTR المضيفة لرسم خرائط لمواقع التكامل فريدة من نوعها لصلة بالموضوع ميزات الجينومية، كما وصفها بشكل عام. وفقا لأسبقية أنشئت من بروتوكولات المنهجية السابقة في هذا المجال 36،38،41-43، ويمكن تطوير البرامج النصية المخصصة لمساعدة الانتهاء من الخطوات المحددة في خط أنابيب المعلوماتية الحيوية. وتتجلى فائدة وحساسية بروتوكول مع بيانات تمثيلية عن طريق تضخيم، والتسلسل، ورسم خرائط HIV-1 مواقع التكامل من الخلايا زراعة الأنسجة المصابة في تعدد التقريبي للعدوى (وزارة الداخلية) من 1.0، فضلا عن سلسلة المعايرة من هذا الحمض النووي المخفف من خلال الحمض النووي الخلوي غير مصاب في 5 أضعاف خطوات لتخفيف الحد الأقصى من 1: 15625 لانتاج ما يعادل وزارة الداخلية التقريبية 6.4 × 10 -5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1326">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">DMEM</td>
			<td style="width:199px;">Gibco</td>
			<td style="width:111px;">11965-084</td>
			<td style="width:780px;">Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">SH 30088.03</td>
			<td>Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">30-002-Cl</td>
			<td>Antibiotics to be added to DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:199px;">Mediatech</td>
			<td style="width:111px;">21-040-CV</td>
			<td>Used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">25-053-CI</td>
			<td>Used to detach adherent cells from tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">PolyJet</td>
			<td style="width:199px;">SignaGen Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">SL100688</td>
			<td>DNA transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:237px;">0.45 &#181;m Filters</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td>09-740-35B</td>
			<td>Used to filter virus particle-containing cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Turbo DNase</td>
			<td style="width:199px;">Ambion</td>
			<td style="width:111px;">AM2239</td>
			<td>Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">HIV-1 p24 Antigen Capture Assay</td>
			<td style="width:199px;">ABL Inc.</td>
			<td style="width:111px;">5447</td>
			<td>Used to quantify yield of virus production</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td style="width:199px;">Qiagen</td>
			<td style="width:111px;">69506</td>
			<td>Used to purify genomic DNA from cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Sonicator</td>
			<td style="width:199px;">Covaris</td>
			<td style="width:111px;">S2</td>
			<td>With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:199px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">G-3250-125</td>
			<td>Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:199px;">Qiagen</td>
			<td style="width:111px;">28106</td>
			<td>Used to purify DNA during library construction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">End-It DNA End-Repair Kit</td>
			<td style="width:199px;">Epicentre</td>
			<td style="width:111px;">ER81050</td>
			<td>Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Klenow Fragment (3&#39;-5&#39; exo&#8211;)</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs (NEB)</td>
			<td style="width:111px;">M0212S</td>
			<td>Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">dATP</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">R0141</td>
			<td>Deoxyadenosine triphosphate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">MseI</td>
			<td style="width:199px;">NEB</td>
			<td>R0525L</td>
			<td>Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">BglII</td>
			<td style="width:199px;">NEB</td>
			<td style="width:111px;">R0144L</td>
			<td>Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:199px;">NEB</td>
			<td style="width:111px;">M0202L/6218</td>
			<td>Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DNA Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>custom</td>
			<td>Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs &#60;30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Advantage 2 Polymerase Mix</td>
			<td style="width:199px;">Clontech</td>
			<td style="width:111px;">639202</td>
			<td>Commercial mix containing DNA polymerase for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">dNTPs (100 mM solutions)</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">R0181</td>
			<td>Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">NanoDrop</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Spectrophotometer for determination of DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">Qubit Fluorimeter</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">Qubit&#174; 3.0</td>
			<td>Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">2200 TapeStation System</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:111px;">G2964AA</td>
			<td>Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:237px;">MiSeq</td>
			<td style="width:199px;">Illumina</td>
			<td style="width:111px;">SY-410-1003</td>
			<td>Used for NGS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

amplification, next-generation sequencing, and genomic dna mapping of retroviral integration sites

الفيروسات القهقرية معرض تفضيلات التكامل التوقيع على كل من المستويين المحلي والعالمي. هنا، نقدم بروتوكول مفصل ل(1) جيل من مكتبات متنوعة من مواقع التكامل فيروسات باستخدام PCR (LM-PCR) والتضخيم بوساطة ربط وتسلسل الجيل التالي (خ ع)، (2) رسم خرائط الموقع الجيني لكل virus- تستضيف ملتقى باستخدام BEDTools، و (3) تحليل البيانات الإحصائية لأهميتها. تجزئة الحمض النووي الجيني المستخرجة من الخلايا المصابة عن طريق الهضم مع الانزيمات تقييد أو صوتنة. بعد مناسبة الحمض النووي نهاية إصلاح، و تربط linkers المزدوج تقطعت بهم السبل على نهايات الحمض النووي، ويجري شبه متداخلة PCR باستخدام بادئات التكميلية لكل من طويلة تكرار محطة (LTR) نهاية الفيروس والحمض النووي رابط ligated. الاشعال PCR تحمل متواليات اللازمة لتجميع الحمض النووي خلال NGS، يلغي الحاجة إلى ربط محول منفصل. وتجري مراقبة الجودة (QC) لتقييم تفتيت الحمض النووي حجم التوزيع والتكيفإيه التأسيس الحمض النووي قبل خ ع. يتم تصفيتها ملفات الإخراج تسلسل LTR التي تحتوي يقرأ، وتسلسل تحديد LTR ورابط واقتصاص بعيدا. يتم تعيين قلص تسلسل الخلية المضيفة لجينوم مرجع باستخدام بلاط ويتم تصفيتها عن الهوية الحد الأدنى 97٪ إلى نقطة وحيدة في الجينوم المرجعية. هي تمحيص مواقع التكامل فريدة من نوعها لالنوكليوتيدات المجاورة (الإقليم الشمالي) تسلسل والتوزيع النسبي لمختلف الخصائص الجينومية. باستخدام هذا البروتوكول، مكتبات موقع تكامل عالية التعقيد يمكن بناؤها من الحمض النووي الجيني في ثلاثة أيام. وبالتالي يمكن إجراء بروتوكول بأكمله الذي يشمل التهاب فيروسي خارجي من خلايا نسيج الثقافة عرضة للتحليل الموقع التكامل في ما يقرب من 1-2 أسابيع. التطبيقات الحديثة لهذه التكنولوجيا تتعلق التحليل الطولي للمواقع التكامل من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.

الجدول 4 قوائم نتائج تجربة تمثيلية لتوضيح حساسية خ ع لاستعادة مواقع التكامل من ثقافة الخلايا المصابة. تم استخدام الحمض النووي الخلوي غير مصاب لتمييع متسلسل الحمض النووي الجيني من عدوى فيه كل خلية في المتوسط ​​تحتوي على التكامل واحد 40.</s...

Watch this Scientific Journal Video about Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites at JoVE.com

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

إينتيراكتومي--Seq: بروتوكول لبناء مكتبة دومينومي والتحقق منها واختيار عرض بالعاثية وتسلسل الجيل القادم

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

توصيف ميكروبيومي التجزئة بالتسلسل Amplicon الرنا الريباسي 16S الجيل المقبل

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

بروتوكول استخراج الحمض النووي للبعوض القائم على الخرز المغناطيسي لتسلسل الجيل التالي

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...