Name: production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.

1. P Domæne Kloning <ol><li> Bestem P domæne kodende region ved sekvens alignment af norovirus stammer (f.eks GII.10 stammen, GenBank: AF504671, FBF-ID: 3ONU) 6. Desuden fjerner den fleksible region ved den C-terminale ende af P-domænet (figur 2A). Codon-optimere DNA&#39;et for E. coli udtryk og omfatter BamHI (N-terminal) og NotI (C-terminale) restriktionssteder med henblik på at sub-klon P domæne kodende region i pMalc2x ekspressionsvektoren 6,7. B...

<ol>
	<li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li><li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+calicivirus.">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li><li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus.">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li><li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals.">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability.">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li><li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+RNA+and+codon+optimization:+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression.">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants.">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li><li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li><li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly.">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle.">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li><li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+noroviruses'+fondness+for+histo-blood+group+antigens.">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li><li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens.">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li></ol>

Her beskriver vi en protokol for ekspression og oprensning af norovirus P-domæner i høj kvalitet og kvantitet. Norovira er ikke godt undersøgt og løbende behov strukturdata. Så vidt vi ved, har P domænenavn produktion ved hjælp af andre protokoller (f.eks GST-mærket P domæner) været problematisk, hidtil, og har været savnet tilstrækkelige strukturelle data om norovirus-vært interaktion. Med den her beskrevne fremgangsmåde, har vi for nylig bidraget væsentligt til forståelsen af ​​de molekyl?...

Menneskelige norovira er den væsentligste årsag til akut gastroenteritis verdensplan 1. Disse virus tilhører Caliciviridae familien, hvoraf der er mindst fem slægter, herunder norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, og Nebovirus. På trods af deres høje effekt på sundhedssystemet og bred fordeling, er studiet af menneskelige norovira hæmmet af manglen på en robust cellekultursystem. Til dato er der ingen godkendte vacciner eller antivirale strategier til rådighed. Den norovirus vigtigste capsidprotein, betegnet VP1, kan opdeles i en skal (S) domæne og en fremspringende (P) domæne 2. P-domænet er forbundet til S-domænet af et fleksibelt hængsel (H) region. S-domænet danner et stillads omkring det virale RNA, hvorimod P-domænet udgør den yderste del af det virale capsid. P domæne samler ind biologisk relevante dimerer, når de udtrykkes i bakterier. P dimer interagerer med carbonhydratstrukturer, betegnet histo-blodgruppeantigener (HBGAs), som er til stede som opløselige antigener i spyt og findes på visse værtsceller 3. P domain-HBGA interaktion menes at være vigtigt for infektion 4. Faktisk en nylig rapport afslørede betydningen af syntetiske HBGAs eller HBGA-udtrykkende bakterier til mennesker norovirus infektion in vitro fem. Aktuelle undersøgelser vedrørende værtscellen fastgørelse af norovira er hovedsageligt udført med viruslignende partikler (VLP&#39;er), der kan udtrykkes i insektceller, eller med rekombinante P domæner udtrykt i Escherichia coli (E. coli). For at forstå P domæne-HBGA interaktioner på atomar opløsning, kan P domæne-HBGA komplekse strukturer løses ved hjælp røntgenkrystallografi. Her beskriver vi en protokol for P domænenavn ekspression og oprensning, der tillader produktion af P domæne høj mængde og kvalitet, der skal bruges til X-ray crystallography. Desuden kan denne metode anvendes til andre calicivirus P domæner og ikke-strukturelle proteiner. P-domænet er kodon-optimeret til E. coli ekspression og klonet ind i en standard transfervektor. P-domænet er derefter igen klonet ind i en ekspressionsvektor, der koder for et polyhistidin (His) -mærke og en mannose-bindende protein (MBP), der er efterfulgt af et proteasespaltningssted. MBP-His-P domæne-fusionsprotein udtrykkes i E. coli, efterfulgt af tre oprensningstrin. MBP-His-P domæne-fusionsprotein oprenses under anvendelse af immobiliseret metalion-affinitetskromatografi (IMAC). Dernæst fusionsproteinet spaltes med humant rhinovirus (HRV) 3C protease og P-domænet er adskilt fra MBP-His med yderligere IMAC oprensningstrin. Endelig er P domæne oprenset ved anvendelse gelpermeationskromatografi (SEC). Den oprensede P domæne kan derefter anvendes til røntgenkrystallografi. Screening af protein krystallisationsbetingelser er PerfoRMED med kommercielt tilgængelige screening kits ved hjælp af forskellige P domæne proteinkoncentrationer. observeres krystalvækst og de mest lovende betingelser optimeres. Med de metoder, der er beskrevet her, er det muligt at gå fra gen til protein til struktur inden for mindre end fire uger. Derfor er vores fremgangsmåde til P domæne ekspression, oprensning og krystallisation er egnet til at studere norovirus-vært interaktion på molekylært niveau og giver vigtige data til at bistå med up-to-date vaccine design og lægemiddelscreening.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>P domain DNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GeneArt Gene Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMalc2x&#160; vector</td>
			<td>On request</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column Chromatography Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td>2.5 cm x 10 cm, possible to use other size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>various</td>
			<td>cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRV 3C Protease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>71493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-34</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG Core suites</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>various</td>
			<td>4 screens with each 96 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbohydrates</td>
			<td>Dextra Laboratories, UK</td>
			<td>various</td>
			<td>Blood group products</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography

Den norovirus kapsid består af en enkelt større strukturelt protein, kaldet VP1. VP1 er opdelt i en skal (S) domæne og en fremspringende (P) domænet. S-domænet danner en sammenhængende stillads omkring det virale RNA, mens P domæne former virale pigge på S domæne og indeholder determinanter for antigenicitet og vært-celle-interaktioner. P-domænet binder carbohydratstrukturer, dvs.., Histo-blodgruppeantigener, der menes at være vigtige for norovirus infektioner. I denne protokol, beskriver vi en metode til at producere høj kvalitet norovirus P-domæner i høje udbytter. Disse proteiner kan derefter anvendes til røntgenkrystallografi og ELISA for at undersøge antigenicitet og vært-celle-vekselvirkninger. P domæne er først klonet ind i en ekspressionsvektor og derefter udtrykkes i bakterier. Proteinet oprenses ved hjælp af tre trin, der involverer immobiliserede metal-ion-affinitetskromatografi og gelpermeationskromatografi. Iprincip, er det muligt at klone, udtrykke, rense, og krystallisere proteiner i mindre end fire uger, hvilket gør denne protokol et hurtigt system til analyse nyligt opståede norovirus stammer.

Den skematiske af den beskrevne protokol er afbildet i figur 1. Protokollen omfatter 6 store dele, der omfatter kloning af målgenet, ekspression, en tre-trins oprensning og krystallisation. Figur 2 illustrerer udformningen af ekspressionskonstruktionen (EF) og karakteristika pMalc2x ekspressionsvektor. Sekvensen for det multiple kloningssite (MCS), i pMalc2x vektoren viser restriktions- og proteasespaltningssites. Figur 3 viser repræse...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Produktion af Menneskelige Norovirus fremspringende domæner i<em&gt; E. coli</em&gt; Til røntgenkrystallografi

Her beskriver vi en fremgangsmåde til at udtrykke og oprense kvalitet norovirus høj udragende (P) domæner i E. coli til anvendelse i røntgenkrystallografi undersøgelser. Denne metode kan anvendes på andre calicivirus P domæner, såvel som ikke-strukturelle proteiner, dvs.., Viralt protein genom-linked (VPG), protease, og RNA-afhængige RNA-polymerase (RdRp).

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

En bekvem og General Expression Platform for produktion af secernerede proteiner fra humane celler

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

3D Printing af præklinisk X-ray Computed tomografisk Datasæt

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...