Name: production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.

1. P Domain Klonen <ol><li> Bepaal de P-domein coderende gebied door middel van sequentie uitlijning van norovirus stammen (bijv GII.10 stam, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) 6. Bovendien verwijdert het flexibele gebied aan het C-uiteinde van het P-domein (Figuur 2A). Codon-geoptimaliseerd DNA voor E. coli expressie en omvatten BamHI (N-terminal) en Notl (C-terminal) restrictie sites om sub-kloon van de P-domein coderende gebied in de pMalc2x expressievector 6,7.</sup...

<ol>
	<li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li><li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+calicivirus.">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li><li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus.">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li><li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals.">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability.">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li><li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+RNA+and+codon+optimization:+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression.">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants.">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li><li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li><li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly.">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle.">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li><li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+noroviruses'+fondness+for+histo-blood+group+antigens.">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li><li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens.">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li></ol>

Hier beschrijven we een protocol voor de expressie en zuivering van norovirus P domeinen in hoge kwaliteit en kwantiteit. Norovirussen zijn niet goed bestudeerd en structurele gegevens worden voortdurend nodig. Voor zover wij weten, heeft P domein productie met behulp van andere protocollen (bv-GST gelabeld P domeinen) problematisch geweest, tot nu toe, en voldoende structurele gegevens over norovirus-gastheer interactie hebt gemist. Met de hier beschreven methode, hebben we onlangs aanzienlijk bijgedragen aan ...

Human noroviruses zijn de belangrijkste oorzaak van acute gastro-enteritis in de wereld 1. Deze virussen behoren tot de familie Caliciviridae, waarvan er ten minste vijf geslachten, met inbegrip van Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus en Nebovirus. Ondanks hun grote impact op de gezondheidszorg en de brede verspreiding, is de studie van de menselijke norovirussen gehinderd door het ontbreken van een robuust celcultuur systeem. Tot op heden zijn er geen goedgekeurde vaccins of antivirale strategieën beschikbaar. Norovirus belangrijkste capside eiwit VP1 genoemd, kan worden verdeeld in een omhulsel (S) domein en een uitstekend (P) domein 2. De P-domein is verbonden met het S domein een flexibel scharnier (H) gebied. De S-domein vormt een steiger rond het virale RNA, terwijl de P-domein vormt de buitenste deel van het virale capside. P domein verzamelt in biologisch relevante dimeren bij expressie in bacteriën. De Pdimer interageert met koolhydraten structuren, genaamd histo-bloedgroep antigenen (HBGAs), die aanwezig is als oplosbare antigenen in het speeksel en te vinden op bepaalde gastheercellen 3 zijn. De P-domein HBGA interactie gedacht belangrijk voor infectie 4 te zijn. Inderdaad, een recent rapport bleek het belang van synthetische HBGAs of HBGA expressie bacteriën voor menselijke norovirus infectie in vitro 5. Huidige studies over de gastheercel hechting van noroviruses hoofdzakelijk uitgevoerd met virusachtige deeltjes (VLP&#39;s) die kunnen worden uitgedrukt in insectencellen of recombinant P-domeinen tot expressie gebracht in Escherichia coli (E. coli). Om de P-domein-HBGA interacties op atomaire resolutie te begrijpen, kan P domein HBGA complexe structuren worden opgelost met behulp van X-ray kristallografie. We beschrijven hier een protocol P domein expressie en zuivering waarmee de productie van P-domein in hoge hoeveelheid en kwaliteit te gebruiken voor X-ray CrystallOGRAFIE. Bovendien kan deze methode worden toegepast voor andere calicivirus P domeinen en niet-structurele proteïnen. De P domein codon-geoptimaliseerd voor E. coli expressie en gekloond in een standaard overdracht vector. De P domein wordt vervolgens opnieuw gekloneerd in een expressievector die een polyhistidine (His) tag en een mannose-bindend eiwit (MBP) die gevolgd worden door een protease-splitsingsplaats codeert. De MBP-His-P domein fusieproteïne wordt tot expressie gebracht in E. coli, gevolgd door drie zuiveringsstappen. De MBP-His-P-domein fusieproteïne gezuiverd met geïmmobiliseerd metaalion affiniteitschromatografie (IMAC). Vervolgens wordt het fusie-eiwit geknipt met humaan rhinovirus (HRV) -3C protease en de P-domein wordt van het MBP-His met een extra IMAC zuiveringsstap. Tenslotte wordt de P domein gezuiverd met size exclusion chromatografie (SEC). Het gezuiverde P domein kan dan worden gebruikt voor röntgenkristallografie. Screening van eiwit kristallisatie voorwaarden performed met commercieel verkrijgbare screening kits met behulp van verschillende P-domein eiwit concentraties. Kristalgroei wordt waargenomen en de meest veelbelovende omstandigheden worden geoptimaliseerd. Met de hier beschreven methoden, is het mogelijk om van gen eiwit te structureren in minder dan vier weken. Daarom is onze werkwijze P domein expressie, zuivering en kristallisatie geschikt norovirus-gastheer interacties op moleculair niveau verschaffen belangrijke gegevens helpt bij up-to-date vaccinontwerp en drug discovery.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>P domain DNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GeneArt Gene Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMalc2x&#160; vector</td>
			<td>On request</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column Chromatography Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td>2.5 cm x 10 cm, possible to use other size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>various</td>
			<td>cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRV 3C Protease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>71493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-34</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG Core suites</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>various</td>
			<td>4 screens with each 96 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbohydrates</td>
			<td>Dextra Laboratories, UK</td>
			<td>various</td>
			<td>Blood group products</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography

Norovirus capside is samengesteld uit een enkele belangrijke structurele eiwit VP1 genoemd. VP1 is onderverdeeld in een omhulsel (S) domein en een uitstekend (P) domein. De S-domein vormt een aaneengesloten steiger rond het virale RNA, terwijl de P-domein vormen virale spikes op de S domein en bevat determinanten voor antigeniciteit en gastheer-cel interacties. De P-domein bindt koolhydraatstructuren, dwz., Histo-bloedgroep antigenen, die vermoedelijk belangrijk norovirus infecties. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het produceren van hoogwaardige norovirus P domeinen in hoge opbrengsten. Deze eiwitten kunnen vervolgens worden gebruikt voor röntgenkristallografie en ELISA om antigeniciteit en gastheer-cel interacties te bestuderen. De P domein wordt eerst gekloneerd in een expressievector en tot expressie gebracht in bacteriën. Het eiwit wordt gezuiverd met behulp van drie stappen die gepaard geïmmobiliseerde metaalion-affiniteitschromatografie en gelpermeatiechromatografie. Inprincipe is het mogelijk om te klonen, express, zuiveren en kristalliseren eiwitten in minder dan vier weken, die dit protocol een snel systeem voor het analyseren van opkomende norovirus stammen maakt.

Het schema van de beschreven protocol is in Figuur 1. Het protocol omvat 6 belangrijke delen die klonering van het doelwitgen, expressie, een drie-staps zuivering en kristallisatie omvatten. Figuur 2 illustreert het ontwerp van het expressieconstruct (EC) en kenmerken van de pMalc2x expressievector. De volgorde van de meervoudige kloneringsplaats (MCS) van de pMalc2x vector toont restrictie en protease splitsingsplaatsen. Figuur 3 toont ...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

De productie van de mens Norovirus uitstekende Domeinen in<em&gt; E. coli</em&gt; Voor röntgenkristallografie

Hier beschrijven we een werkwijze uit te drukken en te zuiveren uitstekende kwaliteit norovirus (P) domeinen in E. coli voor röntgen- kristallografie studies. Deze methode kan worden toegepast op andere calicivirus P domeinen, alsmede niet-structurele eiwitten, bijv., Viraal eiwit-gekoppelde genoom (VPG), protease en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp).

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformatie van plasmide DNA in E. coli Met behulp van de heat shock-methode

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Niet-invasieve 3D-visualisatie met Sub-micron resolutie met behulp van synchrotronstraling-X-ray-tomografie

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Visualisatie van UV-geïnduceerde Replicatie Intermediates in E. coli Met behulp van twee-dimensionale Agarose gel-analyse

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Eiwitkristallisatie voor X-ray kristallografie

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

3D Printing van preklinisch X-ray computertomografie tomografische gegevens Sets

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...