Name: production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.

1. P Domain Cloning <ol><li> Déterminer la région P domaine de codage par alignement de séquences des souches de norovirus (par exemple, la souche GII.10, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) 6. En outre, retirer la région flexible à l&#39;extrémité C-terminale du domaine P (figure 2A). Optimiser les codons d&#39; ADN pour E. expression coli et comprennent BamHI (N-terminal) et Notl (C-terminal) des sites de restriction afin de sous-clone le domaine P région c...

<ol>
	<li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li><li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+calicivirus.">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li><li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus.">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li><li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals.">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability.">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li><li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+RNA+and+codon+optimization:+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression.">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants.">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li><li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li><li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly.">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle.">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li><li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+noroviruses'+fondness+for+histo-blood+group+antigens.">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li><li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens.">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li></ol>

Ici, nous décrivons un protocole pour l&#39;expression et la purification de P domaines de norovirus en haute qualité et la quantité. Les norovirus sont pas bien étudiés et les données structurelles sont continuellement nécessaires. À notre connaissance, la production de domaine P en utilisant d&#39; autres protocoles (par exemple, P domaines de la TPS-étiqueté) a été problématique, à ce jour, et les données structurelles suffisantes sur l&#39; interaction norovirus-hôte ont été portées dispa...

Les norovirus humains sont la principale cause de gastro - entérite aiguë dans le monde 1. Ces virus appartiennent à la famille Caliciviridae, dont il existe au moins cinq genres, y compris les norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus et Nebovirus. En dépit de leur fort impact sur le système de santé et une large distribution, l&#39;étude des norovirus humains est entravée par l&#39;absence d&#39;un système de culture cellulaire robuste. À ce jour, il n&#39;y a pas de vaccins approuvés ou stratégies antivirales disponibles. La protéine majeure de capside norovirus, appelé VP1, peut être divisé en une coque (S) et un domaine en saillie (P) domaine 2. Le domaine P est connecté au domaine S par une région charnière flexible (H). Le domaine S forme un échafaudage autour de l&#39;ARN viral, alors que le domaine P constitue la partie la plus extérieure de la capside virale. Le domaine P assemble en dimères biologiquement pertinentes lorsqu&#39;elle est exprimée dans des bactéries. P dimer interagit avec les structures d&#39;hydrates de carbone, appelés antigènes des groupes sanguins (histo-HBGA) qui sont présents comme des antigènes solubles dans la salive et dans certaines cellules hôtes 3. Le P domain-HBGA interaction est considéré comme important pour l&#39; infection 4. En effet, un rapport récent a révélé l&#39;importance de HBGA synthétiques ou HBGA exprimant des bactéries pour l&#39; infection à norovirus humain in vitro 5. Les études actuelles concernant la fixation de la cellule hôte de norovirus sont principalement réalisées avec des particules de type virus (VLP) qui peuvent être exprimées dans des cellules d&#39; insectes ou des domaines P recombinants exprimés dans Escherichia coli (E. coli). Pour comprendre les interactions P domaine HBGA à résolution atomique, des structures complexes P domaine-HBGA peuvent être résolus en utilisant cristallographie aux rayons X. Ici, nous décrivons un protocole pour l&#39;expression P de domaine et de purification qui permet la production de P domaine en grande quantité et de la qualité à utiliser pour crystall X-rayography. En outre, cette méthode peut être appliquée à d&#39;autres domaines calicivirus P et les protéines non structurales. Le domaine P est le codon-optimisé pour E. expression coli et clone dans un vecteur de transfert standard. Le domaine P est ensuite re-cloné dans un vecteur d&#39;expression qui code pour une polyhistidine (His) marqueur et une protéine de liaison au mannose (MBP), qui sont suivies par un site de clivage de protéase. MBP-His-protéine P domaine de fusion est exprimé dans E. coli, suivie par trois étapes de purification. La protéine de fusion MBP-domaine His-P est purifié en utilisant une Chromatographie d&#39;affinité d&#39;ions métalliques immobilisés (IMAC). Ensuite, la protéine de fusion est clivée par le rhinovirus humain (HRV) -3C protéase et le domaine P est séparé de la MBP-His par une étape supplémentaire de purification IMAC. Enfin, le domaine P est purifié en utilisant une Chromatographie d&#39;exclusion de taille (SEC). Le domaine P purifié peut ensuite être utilisé pour la cristallographie aux rayons X. Dépistage des conditions de cristallisation des protéines est performé avec des kits de dépistage disponibles dans le commerce en utilisant différentes concentrations de protéine P de domaine. La croissance cristalline est observée et les conditions les plus prometteuses sont optimisées. Avec les procédés décrits ici, il est possible de passer de gène à la protéine à la structure en moins de quatre semaines. Par conséquent, notre méthode d&#39;expression P de domaine, la purification et la cristallisation est approprié pour étudier l&#39;interaction norovirus-hôte au niveau moléculaire et de fournir des données importantes pour aider à la conception et la drogue dépistage mise à jour vaccin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>P domain DNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GeneArt Gene Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMalc2x&#160; vector</td>
			<td>On request</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column Chromatography Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td>2.5 cm x 10 cm, possible to use other size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>various</td>
			<td>cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRV 3C Protease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>71493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-34</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG Core suites</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>various</td>
			<td>4 screens with each 96 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbohydrates</td>
			<td>Dextra Laboratories, UK</td>
			<td>various</td>
			<td>Blood group products</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography

La capside norovirus est constituée d&#39;une seule protéine structurale majeure, appelée VP1. VP1 est subdivisé en une coque (S) et un domaine en saillie (P) domaine. Le domaine S forme un échafaudage contiguë autour de l&#39;ARN viral, tandis que les formes P de domaine de pointes virales sur le domaine S et contient déterminants pour les interactions d&#39;antigénicité et de la cellule hôte. Le domaine P se lie structures d&#39; hydrates de carbone, ie., Les antigènes du groupe histo-sang, qui sont considérés comme importants pour les infections à norovirus. Dans ce protocole, nous décrivons un procédé de production norovirus P domaines de haute qualité avec des rendements élevés. Ces protéines peuvent alors être utilisées pour la cristallographie aux rayons X et ELISA afin d&#39;étudier les interactions d&#39;antigénicité et de la cellule hôte. Le domaine P est d&#39;abord clone dans un vecteur d&#39;expression et exprimé dans des bactéries. La protéine est purifiée en utilisant trois étapes qui consistent à immobilisés Chromatographie d&#39;affinité d&#39;ions métalliques et une Chromatographie d&#39;exclusion de taille. Dansprincipe, il est possible de cloner, exprimer, purifier et cristalliser les protéines en moins de quatre semaines, ce qui rend ce protocole, un système rapide pour analyser les nouvelles souches émergentes de norovirus.

Le schéma du protocole décrit est représenté sur la figure 1. Le protocole comprend 6 parties principales qui comprennent le clonage du gène cible, l&#39; expression d&#39; une purification en trois étapes, et la cristallisation. La figure 2 illustre la conception de la construction d&#39;expression (CE) , et caractéristiques du vecteur d&#39;expression pMalc2x. La séquence du site de clonage multiple (MCS) du vecteur pMalc2x montre restriction e...

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Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production de l&#39;homme Norovirus SAILLANTES Domaines dans<em&gt; E. coli</em&gt; Pour X-ray Crystallography

Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer et purifier les norovirus de haute qualité en saillie (P) dans les domaines E. coli pour une utilisation dans les études de cristallographie aux rayons X. Cette méthode peut être appliquée à d&#39; autres domaines calicivirus P, ainsi que des protéines non structurales, à savoir., Protéines du génome viral lié (VPg), la protéase et l&#39; ARN polymérase dépendante de l&#39; ARN (RdRp).

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

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