Name: production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.

1. P Domain Cloning <ol><li> Bestem P domene kodende region ved sekvenssammenstillingen av norovirus stammer (f.eks GII.10 belastning, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Dessuten fjerner den fleksible området ved den C-terminale enden av den P-domenet (figur 2A). Kodon-optimalisere DNA for E. coli uttrykk og inkluderer BamHI (N-terminal) og Noti- (C-terminal) restriksjonsseter i orden til sub-klone P domene kodende region inn i pMalc2x ekspresjonsvektor 6,7. <...

<ol>
	<li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li><li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+calicivirus.">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li><li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus.">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li><li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals.">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability.">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li><li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+RNA+and+codon+optimization:+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression.">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants.">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li><li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li><li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly.">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle.">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li><li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+noroviruses'+fondness+for+histo-blood+group+antigens.">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li><li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens.">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li></ol>

Her beskriver vi en protokoll for uttrykket og rensing av norovirus P domener i høy kvalitet og kvantitet. Noroviruses er ikke godt studert og strukturelle data er kontinuerlig behov. Så vidt vi vet, har P domene produksjon ved hjelp av andre protokoller (f.eks GST-merket P domener) vært problematisk, så langt, og tilstrekkelige strukturelle data på norovirus-vert samhandling har vært mangler. Med metoden beskrevet her, har vi nylig bidratt vesentlig til forståelsen av de molekylære detaljene for norovi...

Menneske noroviruses er den viktigste årsaken til akutt gastroenteritt på verdensbasis en. Disse virusene tilhører caliciviridae familien, som det er minst fem slekter, inkludert Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, og Nebovirus. Til tross for sin høye innvirkning på helsevesenet og bred distribusjon, er studiet av menneskelige noroviruses hemmet av mangel på en robust cellekultur system. Til dags dato er det ingen godkjente vaksiner eller antiviral strategier tilgjengelig. Den norovirus store kapsidprotein, betegnet VP1, kan deles inn i et skall (S) domene og et fremstikkende (P) domene 2. P-domenet er koblet til S-domenet ved et fleksibelt hengsel (H) region. S-domenet danner et stillas rundt det virale RNA, mens P-domenet danner den ytterste del av det virale kapsid. P domene samler inn biologisk relevante dimer når det uttrykkes i bakterier. P dimer samhandler med karbohydratstrukturer, kalt histo-blodtypeantigener (HBGAs) som er til stede som løselige antigener i spytt og på enkelte vertsceller 3. P domene-HBGA interaksjon antas å være viktig for infeksjon 4. Faktisk en fersk rapport avslørte betydningen av syntetiske HBGAs eller HBGA-uttrykke bakterier for mennesker norovirus-infeksjon in vitro fem. Gjeldende studier angående vertscellefesting av noroviruses er hovedsakelig utført med viruslignende partikler (VLP) som kan uttrykkes i insektceller eller med rekombinante P domener uttrykt i Escherichia coli (E. coli). For å forstå P domene-HBGA interaksjoner på atom oppløsning, kan P domene HBGA komplekse strukturer løses ved hjelp av røntgenkrystallografi. Her beskriver vi en protokoll for P domene ekspresjon og rensing som tillater produksjon av P-domenet i høy kvantitet og kvalitet til å bli brukt for X-ray crystallography. Videre kan denne fremgangsmåte anvendes for andre calicivirus P domener og ikke-strukturelle proteiner. P domenet er kodonoptimaliserte for E. coli-ekspresjon og klonet inn i en standard overføringsvektor. P domene blir deretter på nytt klonet inn i en ekspresjonsvektor som koder for et polyhistidin (His) tag og et mannose-bindende protein (MBP) som er etterfulgt av et protease spaltningssete. MBP-His-P domene fusjonsprotein blir uttrykt i E. coli, etterfulgt av tre rensetrinn. MBP-His-P domene fusjonsproteinet ble renset ved hjelp av immobilisert metallion-affinitetskromatografi (IMAC). Deretter blir fusjonsproteinet spaltes med humant rhinovirus (HRV) 3C protease og P-domenet er skilt fra MBP-His ved et ytterligere IMAC rensetrinn. Til slutt, P domene renset ved anvendelse av størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). Den rensede P domene kan deretter brukes for røntgenkrystallografi. Screening av protein krystallisering forhold er gjengivelseRMED med kommersielt tilgjengelige screening kits med ulike P domeneproteinkonsentrasjoner. Krystallvekst observeres, og de mest lovende betingelsene er optimalisert. Med de metoder som er beskrevet her, er det mulig å gå fra gen til protein for å strukturere i løpet av mindre enn fire uker. Derfor er vår fremgangsmåte for P domene uttrykk, rensing og krystallisering egnet for å studere norovirus-vert interaksjon på molekylært nivå og gir viktige data for å hjelpe til med opp-to-date vaksine utforming og medikament-screening.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>P domain DNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GeneArt Gene Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMalc2x&#160; vector</td>
			<td>On request</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column Chromatography Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td>2.5 cm x 10 cm, possible to use other size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>various</td>
			<td>cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRV 3C Protease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>71493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-34</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG Core suites</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>various</td>
			<td>4 screens with each 96 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbohydrates</td>
			<td>Dextra Laboratories, UK</td>
			<td>various</td>
			<td>Blood group products</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography

Den norovirus kapsid er sammensatt av et enkelt større strukturell protein, betegnet VP1. VP1 er inndelt i et skall (S) domene og et fremstikkende (P) domene. S domene danner en sammenhengende stillas rundt viral RNA, mens P domene former virus pigger på S domene og inneholder determinanter for antigenisitet og vert-celle interaksjoner. P domene binder karbohydratstrukturer, altså., Histo-blodtypeantigener, som antas å være viktig for norovirus-infeksjoner. I denne protokollen beskriver vi en fremgangsmåte for fremstilling av høykvalitets norovirus P domener i høye utbytter. Disse proteinene kan deretter brukes for røntgenkrystallografi og ELISA for å studere antigenisitet og vert-celle-interaksjoner. P-domenet blir først klonet inn i en ekspresjonsvektor og deretter uttrykt i bakterier. Proteinet blir renset ved bruk av tre trinn som involverer immobilisert metall-ion-affinitetskromatografi og størrelse-eksklusjonskromatografi. Iprinsippet er det mulig å klone, ekspress, rense og krystallisere proteiner i mindre enn fire uker, noe som gjør denne protokollen et hurtig system for å analysere nylig nye norovirus stammer.

Skjematisk av den beskrevne protokoll er vist i figur 1. Protokollen omfatter 6 hoveddeler som omfatter kloning av målgenet, ekspresjon, en tre-trinns rensing og krystallisasjon. Figur 2 viser utformingen av ekspresjonskonstruksjonen (EC) og egenskapene til pMalc2x ekspresjonsvektoren. Sekvensen av det multiple kloningssete (MCS) av pMalc2x vektoren viser restriksjons og protease-spaltningsseter. Figur 3 viser representative SDS-PAGE re...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Produksjon av menneske norovirus utstående domener i<em&gt; E. coli</em&gt; For røntgenkrystallografi

Her beskriver vi en metode for å uttrykke og rense høy kvalitet norovirus utstå (P) domener i E. coli for anvendelse ved røntgenkrystallografi studier. Denne fremgangsmåten kan anvendes for andre calicivirus P domener, så vel som ikke-strukturelle proteiner, f.eks., Viralt genom proteinbundet (VPG), protease, og RNA-avhengig RNA-polymerase (RdRp).

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

En praktisk og generelle uttrykket plattform for produksjon av utskilles Proteiner fra menneskeceller

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

3D Printing av Preklinisk X-ray computertomografi datasett

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...