Name: production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.

1. P Domain Kloning <ol><li> Bestäm P domänen kodande regionen genom sekvensuppställning av norovirus stammar (t.ex. GII.10 stam, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Dessutom ta bort den flexibla regionen vid den C-terminala änden av P-domänen (Figur 2A). Kodon-optimera DNA för E. coli uttryck och inkluderar BamHI (N-terminal) och NotI (C-terminala) restriktionsställen för att under klon P domän-kodande regionen i pMalc2x expressionsvek 6,7. Obs:...

<ol>
	<li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li><li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+calicivirus.">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li><li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus.">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li><li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals.">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability.">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li><li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+RNA+and+codon+optimization:+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression.">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants.">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li><li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li><li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly.">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle.">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li><li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+noroviruses'+fondness+for+histo-blood+group+antigens.">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li><li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens.">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li></ol>

Här beskriver vi ett protokoll för uttryck och rening av norovirus P domäner i hög kvalitet och kvantitet. Norovirus är inte väl studerat och strukturdata kontinuerligt behövs. Såvitt vi vet har domän produktion P med hjälp av andra protokoll (t.ex. GST-märkt P domäner) varit problematiskt, så långt, och tillräckliga strukturella uppgifter om norovirus-värd interaktion har saknats. Med den metod som beskrivs här, har vi nyligen bidragit väsentligt till förståelsen av de molekylära detaljern...

Humana norovirus är den största orsaken till akut gastroenterit i hela världen 1. Dessa virus tillhör Caliciviridae familjen, av vilka det finns minst fem släkten, däribland Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus och Nebovirus. Trots sin höga effekt på vården och bred distribution, är studiet av mänskliga norovirus hämmas av bristen på en robust cellodlingssystem. Hittills finns det inga godkända vacciner eller antivirala strategier tillgängliga. Norovirus huvudsakliga kapsidproteinet, benämnd VP1, kan delas in i ett skal (S) domän och en utskjutande (P) domänen 2. P-domänen är ansluten till S-domänen av ett flexibelt gångjärn (H) region. S-domänen bildar en byggnadsställning runt det virala RNA: t, medan det P-domänen bildar den yttersta delen av den virala kapsiden. P-domänen samman i biologiskt relevanta dimerer när det uttrycks i bakterier. P dimer samverkar med kolhydratstrukturer, benämnd histo-blodgruppsantigener (HBGAs) som finns som lösliga antigener i saliv och återfinns på vissa värdceller 3. P domän HBGA interaktion tros vara viktigt för infektion 4. I själva verket visade en färsk rapport om vikten av syntetiska HBGAs eller HBGA uttryckande bakterier för humant norovirusinfektion in vitro 5. Aktuella studier om värdfästcellen av norovirus i huvudsak utförs med viruslika partiklar (VLP) som kan uttryckas i insektsceller eller med rekombinanta P domäner uttrycks i Escherichia coli (E. coli). För att förstå P domän HBGA samverkan på atomär upplösning, kan P domän HBGA komplexa strukturer lösas med hjälp av röntgenkristallografi. Här beskriver vi ett protokoll för P domän expression och rening som gör att produktionen av P-domän i hög kvantitet och kvalitet för att användas för röntgen crystallography. Dessutom kan denna metod användas för andra calicivirus P domäner och icke-strukturella proteiner. P domänen är kodon-optimerad för E. coli expressions och klonades in i en standard överföringsvektor. P domänen är sedan åter klonas in i en expressionsvektor som kodar för en polyhistidin (His) -märkningen och ett mannosbindande protein (MBP) som följs av ett proteas klyvningsstället. MBP-His-P-domän-fusionsprotein uttrycks i E. coli, följt av tre reningssteg. MBP-His-P domänfusionsprotein renas med användning av immobiliserad metalljon-affinitetskromatografi (IMAC). Därefter fusionsproteinet klyvs med humant rhinovirus (HRV) 3C-proteas och P-domänen separeras från MBP-His genom ett ytterligare IMAC reningssteg. Slutligen är P-domänen renades med användning av storlekssorterande kromatografi (SEC). Det renade P-domänen kan sedan användas för röntgenkristallografi. Screening av proteinkristallisationsbetingelser är performed med kommersiellt tillgängliga screening kit med olika P domänproteinkoncentrationer. Kristalltillväxt observeras och de mest lovande förutsättningar optimeras. Med de metoder som beskrivs här, är det möjligt att gå från gen till protein för att strukturera inom mindre än fyra veckor. Därför är vårt sätt att P-domänen uttryck, rening och kristallisation lämplig att studera norovirus-värd samverkan på molekylär nivå och ger viktiga data för att hjälpa till up-to-date vaccin design och läkemedelsscreening.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>P domain DNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GeneArt Gene Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMalc2x&#160; vector</td>
			<td>On request</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column Chromatography Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td>2.5 cm x 10 cm, possible to use other size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>various</td>
			<td>cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRV 3C Protease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>71493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-34</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG Core suites</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>various</td>
			<td>4 screens with each 96 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbohydrates</td>
			<td>Dextra Laboratories, UK</td>
			<td>various</td>
			<td>Blood group products</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography

Norovirus kapsiden består av en enda stor strukturell protein, benämnt VP1. VP1 är indelad i ett skal (S) domän och en utskjutande (P) domänen. S-domänen bildar en sammanhängande byggnadsställning runt virala RNA, medan P domän bildar virala spikar på S-domänen och innehåller bestämningsfaktorer för antigenicitet och värd-cellinteraktioner. P domänen binder kolhydratstrukturer, dvs., Till histo-blodgruppsantigener, som tros vara viktiga för norovirusinfektioner. I detta protokoll, beskriver vi en metod för att producera högkvalitativa norovirus P domäner i höga utbyten. Dessa proteiner kan sedan användas för röntgenkristallografi och ELISA för att studera antigenicitet och värd-cellinteraktioner. P domänen är för det första klonas in i en expressionsvektor och därefter uttryckas i bakterier. Proteinet renas med användning av tre steg som involverar immobiliserade metall-jon-affinitetskromatografi och storleksuteslutningskromatografi. Iprincip är det möjligt att klona, ​​uttrycka, rena och kristallisera proteiner i mindre än fyra veckor, vilket gör detta protokoll ett snabbt system för analys av nya framväxande stammar norovirus.

Schemat för den beskrivna protokollet avbildas i figur 1. Protokollet omfattar 6 stora delar som inkluderar kloning av målgenen, uttryck, ett tre-stegs rening och kristallisation. Figur 2 illustrerar utformningen av expressionskonstruktionen (EG) och egenskaper hos pMalc2x expressionsvektor. Sekvensen för kloningsstället (MCS) i pMalc2x vektorn multipel visar restriktions- och proteas-klyvningsställen. Figur 3 visar representativa S...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Produktion av Human Norovirus utskjutande domäner i<em&gt; E. coli</em&gt; För röntgenkristallografi

Här beskriver vi en metod för att uttrycka och rena hög kvalitet norovirus utskjutande (P) domäner i E. coli för användning i röntgenkristallografi-studier. Denna metod kan tillämpas på andra calicivirus P domäner, såväl som icke-strukturella proteiner, det vill säga., Viralt protein genomet bunden (VPG), proteas, och RNA-beroende RNA-polymeras (RdRp).

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Omvandling av Plasmid DNA i E. coli med metoden Heat Shock

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Icke-invasiv 3D-visualisering med submikrona upplösning Använda Synchrotron-röntgen-tomografi

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Visualisering av UV-inducerade replikering mellanprodukter i E. coli Med hjälp av två-dimensionell agaros-gel Analys

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Protein Kristallisering för röntgenkristallografi

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenes och Funktionell Val Protokoll för riktad evolution av proteiner i E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

En bekväm och General uttryck plattform för produktion av utsöndrade proteiner från humana celler

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

3D Utskrift av preklinisk röntgen datortomografisk Data Sets

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...