Name: production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.

1. P Alan Klonlama <ol><li> Norovirus soylarının dizi hizalama P etki kodlama bölgesini belirlemek (örneğin, GII.10 suşu, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) 6. Ayrıca, p alan (Şekil 2A) C-terminal ucunda, esnek bölümünün ayrılması. E için DNA kodon-optimize E. coli ekspresyonu ve BamHI alt-klonlamak için (N-terminal) ve Notl (C-ucu) sınırlama sitelerini pMalc2x sentezleme vektörü 6,7 bölgeyi kodlayan P alanı bulunmaktadır. No...

<ol>
	<li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li><li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+calicivirus.">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li><li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus.">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li><li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals.">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability.">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li><li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+RNA+and+codon+optimization:+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression.">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants.">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li><li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li><li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly.">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle.">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li><li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+noroviruses'+fondness+for+histo-blood+group+antigens.">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li><li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens.">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li></ol>

Burada yüksek kalite ve miktar norovirus P etki ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol açıklar. Noroviruses iyi çalışılmış değildir ve yapısal verileri sürekli ihtiyaç vardır. Bildiğimiz kadarıyla, diğer protokolleri (örneğin, GST-etiketli P alanları) kullanarak P etki üretimi bugüne kadar, sorunlu olmuştur ve norovirus-konak etkileşimi yeterli yapısal verilerin eksik edilmiştir. yöntem burada açıklanan, biz son zamanlarda bağlayıcı karbohidrat norovirusa moleküler ay...

İnsan Noroviruses akut gastroenterit, dünya çapında 1 başlıca nedenidir. Bu virüsler Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus ve Nebovirus dahil olmak üzere en az beş cins, var olan Calıcıvırıdae ailesine aittir. sağlık sisteminin ve geniş dağılımı üzerindeki yüksek etkisine rağmen, insan Noroviruses çalışma sağlam bir hücre kültürü sisteminin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Bugüne kadar hiçbir onaylı aşılar veya antiviral stratejiler vardır. Norovirus majör kapsid proteini, VP1 olarak da adlandırılan bir tabaka (S) alan ve çıkıntı yapan bir (P) etki 2 ayrılabilir. P etki esnek menteşe (H) bölgeye göre S etki alanına bağlıdır. P etki viral kapsid dıştaki bölümünü oluşturur oysa S etki, viral RNA etrafında bir iskele oluşturur. bakterilerde ifade edildiğinde P etki biyolojik ilgili dimerleri içine toplanır. Öimer karbonhidrat yapıları ile etkileşim, tükürük çözünür antijenler olarak mevcut ve belirli konakçı hücreler 3 bulundu olan histo-kan grubu antijenleri (HBGAs) olarak adlandırılan. P etki alanı HBGA etkileşim enfeksiyonu 4 için önemli olduğu düşünülmektedir. Nitekim, son bir rapor sentetik HBGAs veya in vitro 5 insan norovirus enfeksiyonu için bakteri HBGA-ifade önemini ortaya koymuştur. Noroviruses konakçı hücre eki ile ilgili Güncel çalışmalar çoğunlukla böcek hücrelerinde veya Escherichia coli (E. Coli) &#39;de eksprese edilen rekombinant P alanları ile ifade edilebilir virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler) ile gerçekleştirilmiştir. atomik çözünürlükte P etki alanı HBGA etkileşimleri anlamak için, P etki-HBGA kompleks yapıların X-ışını kristalografisi kullanılarak çözülebilir. Burada, yüksek miktarda ve kalitede P alanının üretimi X-ışını da kristalin için kullanılmasına imkan verir P alan ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol açıklarcoğrafyayı. Dahası, bu yöntem, diğer calicivirüs P alanları ve yapısal olmayan proteinler için uygulanabilir. P etki E. için kodon optimizasyonu E. coli sentezleme ve standart bir aktarım vektörü içine klonlandı. P alanı daha sonra, bir polihistidin bölgesini (His) etiketi ve bir proteaz bölünme sitesi tarafından takip edilen mannoz bağlayıcı protein (MBP) kodlayan bir ekspresyon vektörü içine yeniden klonlanmıştır. MBP-His-P alanı füzyon proteini E. ifade edilir E. coli, üç saflaştırma kademesi takip. MBP-His-P alanı füzyon proteini hareketsizleştirilmiş metal iyonu ilişkisi kromatografisi (IMAC) kullanılarak saflaştırılır. Daha sonra, füzyon proteini, insan rinovirüs (HRV) -3C proteaz ve P alanı ayrılır yarılır MBP-His ek IMAC saflaştırma aşaması. Son olarak, P alan boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırılır. saflaştınldı P alan X-ışını kristalografisi için kullanılabilir. Protein kristalizasyon koşullarına taranması perfo olanFarklı P domain proteini konsantrasyonları kullanılarak piyasada mevcut tarama kitleri ile rmed. Kristal büyüme gözlenir ve en umut verici koşullar optimize edilmiştir. yöntemleri burada tarif ile, en az dört hafta içinde yapısı proteine ​​gen gitmek mümkündür. Bu nedenle, P etki ifadesi, saflaştırma ve kristalizasyon bizim yöntem moleküler düzeyde norovirus-host etkileşimi incelemek ve up-to-date aşı tasarımı ve ilaç tarama yardımcı olmak için önemli veri sağlamak için uygundur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>P domain DNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GeneArt Gene Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMalc2x&#160; vector</td>
			<td>On request</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column Chromatography Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td>2.5 cm x 10 cm, possible to use other size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>various</td>
			<td>cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRV 3C Protease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>71493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-34</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG Core suites</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>various</td>
			<td>4 screens with each 96 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbohydrates</td>
			<td>Dextra Laboratories, UK</td>
			<td>various</td>
			<td>Blood group products</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography

norovirus kapsid tek büyük yapısal protein oluşur, VP1 olarak adlandırılır. VP1, bir tabaka (S) alan ve çıkıntı yapan bir (P) etki bölünür. S etki P etki formları S etki viral sivri ise, viral RNA etrafında bitişik iskele oluşturan ve antijenikliği ve konak hücre etkileşimleri belirleyicilerini içerir. P etki, yani., Düşünülen histo-kan grubu antijenleri, norovirus enfeksiyonları için önemli olduğu, karbonhidrat yapıları bağlar. Bu protokol, yüksek verimlerle kaliteli norovirus P etki üretmek için bir yöntem tarif eder. Bu proteinler daha sonra antijenikliği ve konak hücre etkileşimleri incelemek üzere X-ışını kristalografisi ve ELISA için kullanılabilir. P alan ilk bir ekspresyon vektörü içine klonlanabilir ve bakterilerde ifade edilmektedir. Protein, metal iyon afinite kromatografisi ve boyut dışlama kromatografisi immobilize barındırır üç adım kullanılarak saflaştırılır. İçindeilkesi, ekspres, klonlama arındırmak ve bu protokol yeni ortaya çıkan norovirus suşları analiz etmek için hızlı bir sistem yapar az dört hafta, proteinleri kristalize etmek mümkündür.

Tarif edilen protokol şematik Şekil 2. Protokol hedef genin klonlanması, ekspresyonu, üç aşamalı bir saflaştırma ve kristalizasyon, 6 ana parçaları kapsamaktadır., Şekil 1 &#39;de gösterilen sentezleme konstruktunun tasarımını görüntülemektedir (AT) ve pMalc2x ifade vektörünün özellikleri. PMalc2x vektörünün çoklu klonlama bölgesinin (MCS) dizisi sınırlama ve proteaz parçalama sitesi gösterir. Şekil 3, i...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde<em&gt; E. E. coli</em&gt;, X ışını Kristallografi için

Burada, ifade ve E. (P) etki çıkıntılı yüksek kaliteli Norovirus arındırmak için bir yöntem tarif E. coli X-ışını kristalografisi çalışmalarında kullanılmak üzere. Bu yöntem, diğer calicivirüs P etki, hem de yapısal olmayan proteinleri de uygulanabilir, yani., Virüs protein genom bağlı (VPg), proteaz ve RNA bağımlı RNA polimeraz (RdRp).

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Sinkrotron-X-ray tomografi Sub-mikron Çözünürlük ile Non-invaziv 3D Görselleştirme

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

Preklinik X-ışını bilgisayarlı tomografi Veri 3D Yazdırma Setleri

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...