Name: functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

AOH et MAS reconnaît le Collège des sciences et de l&#39;école Thomas H. Gosnell des sciences de la vie à l&#39;Institut de technologie de Rochester pour le soutien. Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation nationale américaine des sciences (NSF) de prix à AOH MCB-1120541.

NOTE: Les auteurs sont prêts à fournir des souches bactériennes et les plasmides recombinants pour faciliter l&#39;incorporation de l&#39;analyse de complémentation fonctionnelle à des fins d&#39;enseignement pour les personnes qui sont intéressées. Les plasmides qui ont été utilisés pour faciliter les expériences de complémentation fonctionnelle sont énumérées dans le tableau 1. 1. Construction de Plasmides pour la complémentation fonctionnelle <ol><li> Cl...

<ol>
	<li>Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Candida+albicans+gene+for+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+by+complementation+of+S.+cerevisiae+ura3+and+E.+coli+pyrF+mutations.">Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations.</a> Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).</li><li>Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+defines+a+novel+variant+of+the+lysine+biosynthesis+pathway+in+plants.">An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants.</a> Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).</li><li>Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate-derived+amino+acid+biosynthesis+in+Arabidopsis+thaliana.">Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana.</a> The Arabidopsis Book. , (2009).</li><li>Prabhu, P., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+partial+characterization+of+an+L-Tyrosine+aminotransferase+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana.</a> Biochemistry Research International. , 549572 (2010).</li><li>Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+pathogenic+bacteria+in+molecular+pathology.">Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).</li><li>McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate:+meso-2,6-diaminopimelate+ligase+(MurE)+from+Verrucomicrobium+spinosum+DSM+4136T.">Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).</li><li>Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lysine+biosynthesis:+an+evolving+antibiotic+strategy.">Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy.</a> Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical.">(p)ppGpp: still magical.</a> Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).</li><li>Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+response.">The stringent response.</a> Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Chatterji, D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+stringent+response,+ppGpp+and+starvation+signaling.">Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).</li><li>Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+stringent+response+and+survival.">ppGpp: stringent response and survival.</a> J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).</li><li>Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-UV+stress+in+Salmonella+typhimurium:+4-thiouridine+in+tRNA,+ppGpp,+and+pppGpp+as+components+of+an+adaptive+response.">Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response.</a> J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).</li><li>Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+alarms+and+cell+division+in+Escherichia+coli.">Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).</li><li>Mittenhuber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+evolution+of+genes+encoding+bacterial+(p)+ppGpp+synthetases/hydrolases+(the+Rel,+RelA,+and+SpoT+proteins).">Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins).</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).</li><li>Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+rsh+Gene+from+a+Novosphingobium+sp.+Necessary+for+Quorum-Sensing+Signal+Accumulation.">Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation.</a> J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).</li><li>Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+biochemical+analysis+of+the+diaminopimelate+and+lysine+biosynthesis+pathway+in+Verrucomicrobium+spinosum:+Identification+and+partial+characterization+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+and+UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate+ligase.">Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase.</a> Front. Microbiol. 3, 183 (2012).</li><li>Hudson, A. O., Gir&#242;n, I., Dobson, R. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+(DapL)+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).</li><li>Dobson, R. C. J., Gir &#242;n, I., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L,L-Diaminopimelate+Aminotransferase+from+Chlamydomonas+reinhardtii:+A+Target+for+Algaecide+Development.">L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development.</a> PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).</li><li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+regulation,+modulation,+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+pBAD+promoter.">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutants+of+Escherichia+coli+K-12+with+low+activity+of+the+diaminopimelic+acid+adding+enzyme.">Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme.</a> J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).</li><li>Mavrides, C., Orr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecific+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases+in+Escherichia+coli.">Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli.</a> J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).</li><li>Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+deficient+in+the+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases.">Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases.</a> J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).</li><li>Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispecific+quintet+of+aromatic+aminotransferases+that+overlap+different+biochemical+pathways+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).</li><li>Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+stringent+response+in+the+essential+function+if+the+conserved+bacterial+G+protein+CgtA+in+Vibrio+cholera.">Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).</li><li>Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+DNA+cloning+system+for+Gram-negative+bacteria:+construction+of+a+gene+bank+of+Rhizobium+meliloti.">Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).</li><li>Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+enzymatic+characterization+of+a+novel+&#946;-1,6-glucosidase+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and enzymatic characterization of a novel &#946;-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae.</a> J Biosci Bioeng. , (2015).</li><li>Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+ALD1+in+activation+of+local+and+systemic+defenses+in+Arabidopsis.">A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis.</a> Plant J. 40, 200-212 (2004).</li><li>Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+prediction+of+protein+function.">Automatic prediction of protein function.</a> Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).</li><li>Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+the+Arabidopsis+pds1+mutation+with+the+gene+encoding+p-Hyrdoxyphenylpyruvate+dioxygenase.">Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase.</a> Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).</li><li>Mohler, W. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+cell+fusion+analyzed+by+lacZ+complementation+in+mammalian+cells.">Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).</li></ol>

Bon nombre des cours qui font partie intégrante de la biotechnologie et de curriculum bioscience moléculaire à l&#39;Institut de technologie de Rochester ont une composante de laboratoire en plus de la partie de lecture du cours. Le programme d&#39;études pour l&#39;année scolaire 2014-2015 contient un total de 48 cours, dont 29 contiennent un composant de laboratoire qui représentent environ 60%. Un tel cours est Fondements de la biochimie et de pathologie des plantes (FPBP), une conférence / cours de laboratoir...

complémentation fonctionnelle dans le contexte d&#39;élucider la fonction (s) / rôle (s) d&#39;un gène est défini comme la capacité d&#39;un homologue particulier ou d&#39;un gène orthologue pour restaurer un mutant particulier avec un phénotype observable à l&#39;état sauvage lorsque l&#39;homologue ou d&#39;un gène orthologue est introduit en cis ou trans dans l&#39;arrière - plan mutant. Cette technique a été largement utilisée pour isoler et identifier la fonction (s) / rôle (s) de nombreux gènes. Un exemple particulier est l&#39;isolement et l&#39; identification des orotidine-5-phosphate décarboxylase de Candida albicans en utilisant le mutant ura3 de S. cerevisiae et du mutant pyrF E. coli. 1 Les auteurs ont utilisé cette technique pour élucider la fonction des gènes qui sont impliqués dans le métabolisme des acides aminés, le peptidoglycane et la réponse rigoureuse dans leurs programmes de recherche et ont incorporé cette technique dans leurs programmes d&#39;enseignement dans le BBIOTECHNOLOGIE et programme au Rochester Institute of Technology (RIT) Molecular Bioscience (BMB). Les auteurs enseignent Fondements de végétaux Biochimie / Pathologie (FPBP) (Hudson) et Bioseparations: Principes et pratiques (BPP) (Hudson / Savka), deux cours basés division laboratoire supérieure élective dans le programme BMB au RIT. Depuis quelques-uns des sujets qui sont abordés dans les cours sont affiliés à leurs intérêts de recherche, les auteurs ont intégré un grand nombre de techniques et d&#39;outils expérimentaux qui sont utilisés dans leurs programmes de recherche respectifs dans ces deux cours en laboratoire. Un tel exemple est complémentation fonctionnelle comme un exercice de laboratoire pour renforcer les documents de cours relatifs aux acides métabolisme des acides à partir de plantes, peptidoglycane et le métabolisme de réponse rigoureuse à partir de bactéries. Trois des voies d&#39;acides aminés à partir de plantes qui sont abordés dans le cours FPBB sont celui de la lysine (LYS), tyrosine(Tyr) et de la phénylalanine (Phe). La voie est mise en évidence dans le lys cours en raison de l&#39;importance de l&#39;acide aminé comme un acide aminé essentiel pour tous les animaux en particulier les humains puisque les animaux manquent de la machinerie génétique pour synthétiser lys de novo. En outre, on a récemment découvert que les plantes utilisent une voie pour la synthèse de lys qui est significativement différente de celle des bactéries. Cette découverte a été facilitée en partie par complémentation fonctionnelle de E. coli diaminopimélate (PAH) des mutants en utilisant un gène qui code pour l&#39;enzyme L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPI) à partir du Arabidopsis thaliana plante modèle. 2 Les variantes de voies pour la synthèse de Lys à travers la diaminopimélate intermédiaire sont représentés sur la figure 1. En outre , la synthèse de lys facilite par la famille de aspartate dérivée d&#39;acides aminés qui est très réglementé. 3 en plus de leur importance en protéines synthesis, les voies de Tyr et Phe sont mis en évidence compte tenu de leur importance dans le service en tant que composés précurseurs pour l&#39;anabolisme des composés phénylpropanoïdes impliqués la synthèse de composés de défense des plantes telles que:. alcaloïdes, les lignines, les flavonoïdes, les isoflavonoïdes, l&#39; acide hydroxycinnamique entre autres 4 Le tyr et les voies de Phe sont également mis en évidence pour montrer la différence entre la plante et les voies anaboliques bactériennes. Chez les bactéries, la tyrosine aminotransférase enzyme (tyrB) est impliquée dans l&#39;anabolisme des deux acides aminés, tandis que chez les végétaux, l&#39;enzyme est principalement impliqué dans le catabolisme de Tyr et Phe, et n&#39;a pas été impliqué dans l&#39;anabolisme de ces acides aminés. (Figure 2) 4. Les différences entre Gram positif et les bactéries Gram négatives en ce qui concerne la structure du peptidoglycane (PG) sont mis en évidence au cours de FPBP. La PG de bactéries Gram négatives est d&#39;un intérêt en ce qui concerne la pathologie végétale sur la base du fait que la plupartpathogènes des plantes sont Gram négatif. Une étude récente concernant les 10 bactériennes phyto-pathogènes a révélé que tous sont Gram négatif. Les bactéries ont été parmi les genres Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya et Pectobacterium 5 L&#39; une des différences chimiques lors de la comparaison de la souche PG de bactéries Gram négatif et Gram positif est la différence entre la réticulation amino. les acides des deux types. La première étape pour que différente réticulation du PG se produit à l&#39;étape cytoplasmique de PG anabolisme et est facilitée par l&#39;enzyme UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate méso ligase -2,6-diaminopimélate (Mure) (figure 3A). Mure catalyse l&#39;addition d&#39;un composé de diamine particulier à la troisième position de la tige de peptide 6. Dans la plupart des bactéries Gram - négatives, les lys pénultième précurseur, méso -diaminopimelate ( <em&gt; m -DAP) sert de réticulation amino - acide et sert Lys le même rôle dans la PG de la plupart des bactéries Gram - positives (figure 3B). 7 Ceci est dû au fait qu&#39;à la fois m et -DAP Lys possèdent deux amine groupes et sont capables de former deux liaisons peptidiques pour la tige de peptide réticulation. Dans les Bioséparations: Principes et pratiques (BPP) Bien sûr, les différences entre les systèmes ouverts et fermés pour la culture de bactéries et comment nutriment niveaux va changer de manière significative dans les deux systèmes en raison de changements environnementaux sont discutés. Ces événements sont liés aux changements réglementaires appelés un «décalage vers le bas&quot; ou &quot;shift up&quot; déclenché par la faim ou une quantité suffisante d&#39;acides aminés ou de l&#39;énergie. La réponse «rétrograder» peut se produire quand une culture bactérienne est transférée à partir d&#39;un milieu riche et complexe à un milieu défini chimiquement avec une source de carbone unique. Ce changement dans l&#39;environnement conduit à la Cessa rapidetion de la synthèse ARNt et ARNr. Cette cessation résulte en l&#39;absence de ribosomes, les protéines et la synthèse d&#39;ADN, même si la biosynthèse des acides aminés sont régulés à la hausse. Après la réponse «rétrograder», les ribosomes existants sont utilisés pour produire de nouvelles enzymes pour synthétiser les acides aminés ne sont plus disponibles dans le milieu ou l&#39;environnement. Après une période de temps, la synthèse de l&#39;ARNr et les nouveaux ribosomes sont assemblées et la population de cellules bactériennes commence à croître mais à un taux réduit. Le cours des événements est appelé la «réponse stricte» ou «contrôle strict» et est un exemple de la régulation cellulaire globale et peut être considéré comme un mécanisme de réglage des machines biosynthétique de la cellule pour compenser la disponibilité des substrats nécessaires et les besoins énergétiques . 8 la réponse rigoureuse permet ainsi aux bactéries de répondre rapidement aux flux de nutriments dans l&#39;environnement et contribue et enhances la capacité des bactéries à concourir dans des environnements qui peuvent changer rapidement en ce qui concerne la disponibilité des nutriments et ou du substrat. 9/8 La réponse rigoureuse a un rôle essentiel dans l&#39; expression du gène lorsque la disponibilité des acides aminés, le carbone, l&#39; azote, le phosphate et les acides gras sont limités. 8,10-14 Cette réponse rigoureuse est coordonné par deux nucléotides, guanosine tétraphosphate (ppGpp) et guanosine pentaphosphate (pppGpp) communément appelé ensemble comme le alarmone (p) ppGpp. Par exemple, lorsque les acides aminés sont limitées, ce qui peut conduire à un goulot d&#39;étranglement dans la synthèse des protéines, la alarmone, la guanosine 3,5- (bis) Pyrophosphate (ppGpp), dérivée de l&#39;anabolisme de la guanosine diphosphate-3 5-triphosphate (pppGpp) accumule dans la cellule. Le changement de niveau (p) ppGpp est impliqué dans l&#39;expression des gènes qui régulent la réponse à surmonter le manque de substrats dans l&#39;environnement qui sont directement impliqués dans la croissance cellulaire et développement. Deux des gènes qui sont impliqués dans ce processus sont appelés relA et spoT. RelA est un ribosome associé (p) ppGpp synthétase qui est impliquée dans la réponse à l&#39;accumulation des ARNt non chargés qui est le résultat de la limitation de l&#39;acide aminé. fonctions repèrer comme bifonctionnel (p) ppGpp synthétase et hydrolase. L&#39;activité de synthétase de repèrer est impliqué dans la réponse à l&#39;absence de carbone et d&#39; acide gras famine. 8 Les homologues RelA / Tache sont répandus dans les plantes et les bactéries et sont appelées rsh R ela / S POT h omologs. 8,10 -12,16 un manuscrit récent a montré qu&#39;il existe une protéine rsh spécifique impliquée dans la synthèse de ces alarmones de la bactérie Novosphingobium sp Rr 2-17 17. Nous présentons ici quatre voies biochimiques attachés aux essais de complémentation fonctionnelle. Les essais de complémentation décrites dans ce manuscrit fournit une avenue pour explminerai utilisant ce test in vivo comme un moyen d&#39;identifier et de caractériser ou des enzymes qui sont prévues pour avoir une fonction inconnue / putative (s) ou comme outils d&#39;enseignement pour compléter l&#39;enseignement des voies biochimiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
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		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">E. coli mutants</td>
			<td style="width:372px;">Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652082</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature controlled incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Agar</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>22700025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12795084</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M9 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63011</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Medium</td>
			<td>Fisher Scientfic&#160;</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diaminopimelate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92591</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0376</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenlylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gylcerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracyline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10342-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11708-013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15224-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Dh5-alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td align="right">18258012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Top10</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>C4040-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET100D/topo vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCR2.1 Vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K2030-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways

Functional dosage de complémentation (FCA) est un test in vivo qui est largement utilisé pour élucider la fonction / rôle des gènes / enzymes. Cette technique est très courante dans la biochimie, de la génétique et de nombreuses autres disciplines. Une vue d&#39;ensemble de la technique pour compléter l&#39;enseignement des voies biochimiques relatives aux acides aminés, peptidoglycane et la réponse stricte bactérienne est signalée dans ce manuscrit. Deux ADNc de l&#39;organisme modèle Arabidopsis thaliana plante qui sont impliqués dans le métabolisme de la lysine (L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPI) et de la tyrosine aminotransferase (tyrB) impliqués dans le métabolisme de la tyrosine et phénylalanine sont surlignés. En outre, le peptidoglycane bactérien voie anabolique est mis en évidence par l&#39;analyse de la -acetylmuramoyl-l-alanyl-D-glutamate méso ligase -2,6-diaminopimélate (Mure) gène UDP- N à partir de la bactérie Verrucomicrobium spinosum impliqué dans la croix-linking de peptidoglycane. La réponse rigoureuse bactérienne est également signalé par l&#39;analyse de l&#39;rsh (POT h de omolog de ​​r ela / s) gène bifonctionnel responsable d&#39;un phénotype hyper-muqueux dans la bactérie Novosphingobium sp. Quatre exemples de FCA sont présentés. La vidéo se concentrera sur trois d&#39;entre eux, à savoir la lysine, le peptidoglycane et la réponse rigoureuse.

Les souches bactériennes qui sont utilisés dans les différentes analyses de complémentation fonctionnelle sont énumérées dans le tableau 2. Analyse fonctionnelle de complémentation: L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPL) E. coli mutant double AOH1 (Δ :: dapD Kan2, dapE6) héberge une mutation dans le gène...

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Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

La validation des activités enzymatiques impliquées dans les voies biochimiques peut être élucidée en utilisant une analyse de complémentation fonctionnelle (CAF). Décrite dans ce manuscrit est le dosage CAF démontrant l&#39;activité enzymatique des enzymes impliquées dans le métabolisme des acides aminés, de réponse stringente bactérienne et la biosynthèse du peptidoglycane bactérien.

Analyse fonctionnelle complémentation (FCA): Un exercice de laboratoire conçu et mis en complétant l&#39;enseignement des voies biochimiques

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

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