Name: functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

AOH ו MAS מודה המכללה למדע ובית הספר Gosnell Thomas H. למדעי החיים במכון רוצ&#39;סטר לטכנולוגיה לתמיכה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי ארצות הברית הקרן הלאומית למדע (NSF) פרס AOH MCB-1,120,541.

הערה: המחברים מוכנים לספק זני חיידקים ו פלסמידים רקומביננטי כדי להקל על השילוב של ניתוח השלמה פונקציונלי למטרות הוראה ליחידים מעוניינים. פלסמידים ששימשו כדי להקל ניסויים השלמה פונקציונלי מפורטים בטבלה 1. 1. בניית פלסמידי...

<ol>
	<li>Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Candida+albicans+gene+for+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+by+complementation+of+S.+cerevisiae+ura3+and+E.+coli+pyrF+mutations.">Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations.</a> Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).</li><li>Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+defines+a+novel+variant+of+the+lysine+biosynthesis+pathway+in+plants.">An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants.</a> Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).</li><li>Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate-derived+amino+acid+biosynthesis+in+Arabidopsis+thaliana.">Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana.</a> The Arabidopsis Book. , (2009).</li><li>Prabhu, P., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+partial+characterization+of+an+L-Tyrosine+aminotransferase+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana.</a> Biochemistry Research International. , 549572 (2010).</li><li>Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+pathogenic+bacteria+in+molecular+pathology.">Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).</li><li>McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate:+meso-2,6-diaminopimelate+ligase+(MurE)+from+Verrucomicrobium+spinosum+DSM+4136T.">Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).</li><li>Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lysine+biosynthesis:+an+evolving+antibiotic+strategy.">Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy.</a> Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical.">(p)ppGpp: still magical.</a> Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).</li><li>Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+response.">The stringent response.</a> Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Chatterji, D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+stringent+response,+ppGpp+and+starvation+signaling.">Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).</li><li>Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+stringent+response+and+survival.">ppGpp: stringent response and survival.</a> J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).</li><li>Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-UV+stress+in+Salmonella+typhimurium:+4-thiouridine+in+tRNA,+ppGpp,+and+pppGpp+as+components+of+an+adaptive+response.">Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response.</a> J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).</li><li>Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+alarms+and+cell+division+in+Escherichia+coli.">Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).</li><li>Mittenhuber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+evolution+of+genes+encoding+bacterial+(p)+ppGpp+synthetases/hydrolases+(the+Rel,+RelA,+and+SpoT+proteins).">Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins).</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).</li><li>Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+rsh+Gene+from+a+Novosphingobium+sp.+Necessary+for+Quorum-Sensing+Signal+Accumulation.">Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation.</a> J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).</li><li>Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+biochemical+analysis+of+the+diaminopimelate+and+lysine+biosynthesis+pathway+in+Verrucomicrobium+spinosum:+Identification+and+partial+characterization+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+and+UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate+ligase.">Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase.</a> Front. Microbiol. 3, 183 (2012).</li><li>Hudson, A. O., Gir&#242;n, I., Dobson, R. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+(DapL)+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).</li><li>Dobson, R. C. J., Gir &#242;n, I., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L,L-Diaminopimelate+Aminotransferase+from+Chlamydomonas+reinhardtii:+A+Target+for+Algaecide+Development.">L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development.</a> PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).</li><li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+regulation,+modulation,+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+pBAD+promoter.">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutants+of+Escherichia+coli+K-12+with+low+activity+of+the+diaminopimelic+acid+adding+enzyme.">Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme.</a> J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).</li><li>Mavrides, C., Orr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecific+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases+in+Escherichia+coli.">Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli.</a> J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).</li><li>Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+deficient+in+the+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases.">Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases.</a> J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).</li><li>Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispecific+quintet+of+aromatic+aminotransferases+that+overlap+different+biochemical+pathways+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).</li><li>Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+stringent+response+in+the+essential+function+if+the+conserved+bacterial+G+protein+CgtA+in+Vibrio+cholera.">Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).</li><li>Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+DNA+cloning+system+for+Gram-negative+bacteria:+construction+of+a+gene+bank+of+Rhizobium+meliloti.">Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).</li><li>Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+enzymatic+characterization+of+a+novel+&#946;-1,6-glucosidase+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and enzymatic characterization of a novel &#946;-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae.</a> J Biosci Bioeng. , (2015).</li><li>Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+ALD1+in+activation+of+local+and+systemic+defenses+in+Arabidopsis.">A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis.</a> Plant J. 40, 200-212 (2004).</li><li>Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+prediction+of+protein+function.">Automatic prediction of protein function.</a> Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).</li><li>Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+the+Arabidopsis+pds1+mutation+with+the+gene+encoding+p-Hyrdoxyphenylpyruvate+dioxygenase.">Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase.</a> Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).</li><li>Mohler, W. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+cell+fusion+analyzed+by+lacZ+complementation+in+mammalian+cells.">Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).</li></ol>

רבים מן הקורסים הם חלק בלתי נפרדים ביוטכנולוגיה ו הלימודים ביוסיינס המולקולרית בבית המכון הטכנולוגי של רוצ&#39;סטר יש מרכיב מעבדה בנוסף חלק ההרצאה של הקורס. תוכנית הלימודים של שנת הלימודים 2014-2015 מכיל בסך הכל 48 קורסים, 29 מהם מכילים מרכיב מעבדה המייצגים כ -60%. קורס אחד כזה...

השלמה פונקציונלית בהקשר של הבהרת הפונקציה (ים) / תפקיד (ים) של גן מוגדרת כיכולת של הומולוגי בפרט או גן orthologous לשחזר מוטציה מסוימת עם פנוטיפ הנצפה למדינת wild-type כאשר ההומולוגי או גן orthologous הוא הציג ציס או טרנס לתוך רקע המוטציה. טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לבודד ולזהות את הפונקציה (ים) / תפקיד (ים) של גנים רבים. דוגמה מסוימת אחת היא בידוד וזיהוי של decarboxylase orotidine-5-פוספט קנדידה אלביקנס באמצעות מוטציה URA3 של ס cerevisiae ואת מוטצית pyrF של E. coli. 1 המחברים השתמשו בטכניקה זו כדי להבהיר את הפונקציה של גנים מעורבים במטבוליזם של חומצות אמינו, פפטידוגליקן והתגובה מחמירה בתוכניות המחקר שלהם שלבו טכניקה זו לתוכניות ההוראה שלהם Biotechnology ו Bioscience מולקולרית (BMB) תוכנית במכון רוצ&#39;סטר לטכנולוגיה (RIT). המחברים ללמד יסודות הצמח ביוכימיה / פתולוגיה (FPBP) (Hudson) ו Bioseparations: עקרונות ושיטות (BPP) (Hudson / Savka), שני קורסי בחירת חלוקה עליונות במעבדות בתכנית BMB בבית RIT. מכיוון שחלק מן הנושאים נדונים הקורסים מזוהים עם תחומי המחקר, החוקרים שלבו רבים של טכניקות וכלים ניסיוניים המשמשות בתוכניות המחקר שלהם לשתי אלה מבוססי קורסי מעבדה. דוגמא אחת כזו היא השלמה פונקציונלית כתרגיל במעבדה כדי לחזק את חומרי הרצאה הנוגעים אמינו מטבוליזם חומצה מצמח, פפטידוגליקן ואת חילוף חומרי תגובה המחמיר מחיידקים. שלושת מסלולי חומצת אמינו מצמחים הנדונות בקורס FPBB הם של ליזין (ליס), טירוזין(Tyr) ו פנילאלנין (Phe). מסלול ליס מודגש כמובן בגלל החשיבות של החומצות אמיניות כמו חומצת אמינו חיונית עבור כל בעלי החיים במיוחד בני האדם מאז חיות חסרות את המנגנון הגנטי לסנתז ליס דה נובו. בנוסף, התגלה לאחרונה כי מפעלים מעסיקים מסלול לסינתזה של ליס שונה מהותית מזו של חיידקים. תגלית זו התאפשרה חלקית על ידי השלמה תפקודית של E. coli diaminopimelate (DAP) מוטנטים באמצעות הגן המקודד את האנזים L, L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) מן thaliana ארבידופסיס צמח המודל. 2 מסלולים גרסה לסינתזה של ליס דרך diaminopimelate ביניים מוצגים באיור 1. בנוסף , הסינתזה של ליס מקלה דרך המשפחה נגזר aspartate של חומצות אמינו אשר פיקוח הדוק. 3 בנוסף וחשיבותם synt חלבוןhesis, המסלולים עבור Tyr ו Phe מודגשים נתונים וחשיבותם משמשים תרכובות מבשרות על אנאבוליזם של תרכובות phenylpropanoid מעורבים בסינתזה של תרכובות גינת צמח כגון:. אלקלואידים, lignins, פלבנואידים, isoflavonoids, חומצת hydroxycinnamic בין היתר 4 Tyr שבילי Phe מודגשים גם להראות את ההבדל בין המפעל לבין המסלולים אנבוליים חיידקים. אצל חיידקים, aminotransferase טירוזין אנזים (TyrB) מעורב אנאבוליזם של חומצות אמינו, ואילו צמחים, האנזים מעורב בעיקר פירוק של Tyr ו Phe והוא אינו מעורב אנאבוליזם של חומצות אמינו אלו. (איור 2). 4 ההבדלים בין גראם חיוביים חיידקים גרם-שליליים לגבי מבנהו של פפטידוגליקן (PG) מודגשים הקורס FPBP. האחריות ההורית של חיידקים גראם שליליים הוא אינטרסים בכל הנוגע בטיפול מחלות צמחים מבוססים על העובדה כי רובפתוגנים צמח הם גראם שליליים. הסקירה אחרונה לגבי 10 פתוגנים פייטו חיידקים העליונים חשפה שכל הם שלילי גראם. החיידקים היו מן הסוגים:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya ו Pectobacterium 5 אחד ההבדלים הכימיים כאשר משווה בין גזע PG של חיידקים חיוביים שליליים גראם גרמו ההבדל בין אמינו מקשרים הצולב חומצות של שני הסוגים. השלב הראשוני כי cross-linking השונה של PG מתרחש בשלב cytoplasmic של אנאבוליזם PG והוא בהנחייתם של האנזים UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- טווה אנזים -2,6-diaminopimelate (Mure) (איור 3 א). Mure מזרז תוספת של תרכובת diamine מסוימת במיקום השלישי של גזע פפטיד. 6 אצל החיידקים השליליים ביותר גראם, את ליס הלפני האחרון מבשר, טווה -diaminopimelate ( <em&gt; -DAP מ &#39;) משמש cross-linking חומצת אמינו ליס משרתת אותו תפקיד PG של חיידקים חיוביים ביותר גראם (איור 3 ב). 7 זאת בשל העובדה כי הן מ -DAP ו ליס להחזיק שני אמין קבוצות מסוגלות להרכיב שני קשרים פפטידיים עבור גזע פפטיד cross-linking. בשנתי ה Bioseparations: עקרונות והשיטות (BPP) כמובן, את ההבדלים בין מערכות פתוחות וסגורות לגידול חיידקים וכיצד רמות המזין ישתנה באופן משמעותי בשני המערכות בשל שינויים סביבתיים הם דנו. אירועים אלו צמודים לשינויים רגולטוריים שנקראו &quot;משמרת למטה&quot; או &quot;משמר את&quot; מופעל על ידי רעב או אספקה ​​נאותה של חומצות אמינו או אנרגיה. &quot;המשמרת למטה&quot; התגובה יכולה להתרחש כאשר תרבית חיידקים מועברת מדיום עשיר ומורכב עד בינוני הגדרה כימית עם מקור פחמן יחיד. שינוי זה בסביבה מובילה cessa המהירהtion של סינתזת tRNA ו rRNA. תוצאות הפסקת זה בחוסר ריבוזומים, חלבון וסינתזה DNA למרות ביוסינתזה של חומצות אמינו הן שהוגברו. בעקבות התגובה &quot;משמרת למטה&quot;, הריבוזומים הקיימים משמשים לייצור אנזימים חדשים לסנתז את חומצות אמינו אינה זמינה יותר בטווח הבינוני או הסביבה. לאחר פרק זמן מסוים, סינתזת rRNA וריבוזומים חדשים עברו הרכבה ואת אוכלוסיית תאים חיידקיים מתחילה לגדול אף בשיעור מופחת. את מהלך האירועים שמכונה &quot;תגובה המחמירה&quot; או &quot;בקרה מחמירה&quot; והוא דוגמא של רגולצית הסלולר העולמית יכול להיחשב מנגנון התאמת מנגנון biosynthetic של התא כדי לפצות על הזמינות של מצעים הנדרשים צרכי אנרגיה 8. התגובה המחמירה ובכך מאפשרת לחיידקים להגיב במהירות ונתיבים של חומרים מזינים בסביבה ותורמת ו enhהשונויות המוס רות היכולת של חיידקים להתחרות בסביבות שיכול להשתנות במהירות לגבי מזין או זמינות המצע. 8-9 התגובה המחמירה יש תפקיד אינטגרלי ביטוי גנים כאשר הזמינות של חומצות אמינו, פחמן, חנקן, פוספט, וחומצות שומן מוגבלת. 8,10-14 זה תגובה מחמירה מרוכזת על ידי שני נוקלאוטידים, tetraphosphate guanosine (ppGpp) ו guanosine pentaphosphate (pppGpp) התייחס יחד בכינויו alarmone (p) ppGpp. לדוגמה, כאשר חומצות אמינו מוגבלים-מה שעלול להוביל צוואר בקבוק בסינתזה-החלבון alarmone, guanosine 3,5- (BIS) pyrophosphate (ppGpp), נגזר אנאבוליזם של guanosine 3-diphosphate 5 אדנוזין (pppGpp) מצטבר בתא. השינוי (p) רמת ppGpp מעורב ביטוי של גנים המווסתים את התגובה להתגבר על חוסר המצעים בסביבה כי הם מעורבים ישירות צמיחת תאי development. שני הגנים המעורבים בתהליך זה נקראים רלה ספוט. רלה הוא synthetase הקשורים-הריבוזום (p) ppGpp כי הוא מעורב תגובת ההצטברות של tRNAs טעון כי הוא התוצאה של הגבלה של חומצות אמיניות. פונקציות ספוט כמו synthetase ו hydrolase bifunctional (p) ppGpp. פעילות synthetase של ספוט מעורבת בתגובת חוסר רעב פחמן חומצות שומן. 8 homologs רלה / ספוט נפוץ בצמחים ובבעלי חיידקים מכונים RSH עבור omologs R ELA / S סיר h. 8,10 -12,16 כתב יד שנערך לאחרונה הראה כי קיים חלבון RSH ספציפי המעורבים בסינתזה של alarmones אלה מן Rr sp החיידק Novosphingobium 2-17. 17 כאן אנו מציגים ארבעה הביוכימיים קשורים אל מבחני ההשלמה הפונקציונליים. מבחני ההשלמה המפורטים בכתב היד הזה מספק שדרה Explעפרות העסקת assay in vivo זה כאמצעי זיהוי או מאפיינת אנזימים שהם חזו יש פונקציה ידועה / משוערת (ים) או ככלי הוראה להשלים את הוראת הביוכימיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">E. coli mutants</td>
			<td style="width:372px;">Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652082</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature controlled incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Agar</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>22700025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12795084</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M9 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63011</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Medium</td>
			<td>Fisher Scientfic&#160;</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diaminopimelate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92591</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0376</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenlylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gylcerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracyline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10342-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11708-013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15224-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Dh5-alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td align="right">18258012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Top10</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>C4040-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET100D/topo vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCR2.1 Vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K2030-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways

Assay השלמה הפונקציונלית (FCA) היא assay in vivo כי נעשה שימוש נרחב על מנת להבהיר את הפונקציה / התפקיד של גנים / אנזימים. טכניקה זו נפוצה מאוד ביוכימיה, גנטיקה ותחומים רבים אחרים. סקירה מקיפה של הטכניקה כדי להשלים את הוראת הביוכימיים הקשורים לחומצות אמינו, פפטידוגליקן והתגובה מחמירה החיידקים מדווחת כתב היד הזה. שני cDNAs מן thaliana ארבידופסיס האורגניזם צמח מודל מעורבים במטבוליזם של ליזין (L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) ו aminotransferase טירוזין (tyrB) המעורבים במטבוליזם של טירוזין ו פנילאלנין מודגשים. בנוסף, פפטידוגליקן חיידקי מסלול אנבוליים מודגש באמצעות הניתוח של גן UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- טווה אנזים -2,6-diaminopimelate (Mure) מן spinosum חיידק Verrucomicrobium מעורב הצלב-linking של פפטידוגליקן. התגובה מחמירה החיידקים מדווחת גם באמצעות הניתוח של RSH (omolog h הסיר s r ELA /) גן bifunctional אחראי פנוטיפ היפר-רירני ב sp Novosphingobium החיידק. ארבע דוגמאות של FCA מוצגות. הווידאו יתמקד בשלושה מהם, כלומר ליזין, פפטידוגליקן ואת התגובה המחמירה.

<html> זני החיידקים כי מועסקי הניתוחים השלמים הפונקציונליים השונים מפורטים בטבלה 2. ניתוח השלמה פונקציונלית: L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

התיקוף של פעילות אנזימטית מעורבת הביוכימיים ניתן הובהר באמצעות ניתוח השלמה תפקודי (FCA). מתואר בכתב היד הזה הוא assay FCA הוכחת הפעילות האנזימטית של אנזימים מעורבים במטבוליזם של חומצות אמינו, תגובה מחמירה חיידקים וביוסינטזה פפטידוגליקן חיידקים.

השלמת אנליזה פונקציונלית (FCA): תרגיל מעבדה ומומש כדי להשלים את הוראת הביוכימיים

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

השתלת עדשה של דג הזברה Application שלה ניתוח של מוטאנטים העין

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

השלמה Fluorescence bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

לקבוע את התרומה של מערכות אנרגיה במהלך פעילות גופנית

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

מדידת פעילות אנזימטי לקטאז במעבדת ההוראה

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

זיהוי ליגנדים אסטרוגניים במוצרי טיפוח אישי באמצעות של שמרים אסטרוגן מסך ממוטב עבור המעבדה הוראה לתואר ראשון

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...