Name: functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

AOH e MAS riconosce il College of Science e Thomas H. Gosnell School of Life Sciences presso il Rochester Institute of Technology per il supporto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Stati Uniti National Science Foundation (NSF) premio a AOH MCB-1.120.541.

NOTA: Gli autori sono disposti a fornire ceppi batterici e plasmidi ricombinanti per facilitare l&#39;inserimento di analisi complementazione funzionale a scopo didattico per gli individui che sono interessati. I plasmidi che sono stati utilizzati per facilitare esperimenti di complementazione funzionali sono elencati nella Tabella 1. 1. Costruzione di plasmidi per complementazione funzionale <ol><li> Clonazione di Diaminopimelate aminotransferasi (dapL) per complementazio...

<ol>
	<li>Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Candida+albicans+gene+for+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+by+complementation+of+S.+cerevisiae+ura3+and+E.+coli+pyrF+mutations.">Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations.</a> Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).</li><li>Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+defines+a+novel+variant+of+the+lysine+biosynthesis+pathway+in+plants.">An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants.</a> Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).</li><li>Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate-derived+amino+acid+biosynthesis+in+Arabidopsis+thaliana.">Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana.</a> The Arabidopsis Book. , (2009).</li><li>Prabhu, P., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+partial+characterization+of+an+L-Tyrosine+aminotransferase+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana.</a> Biochemistry Research International. , 549572 (2010).</li><li>Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+pathogenic+bacteria+in+molecular+pathology.">Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).</li><li>McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate:+meso-2,6-diaminopimelate+ligase+(MurE)+from+Verrucomicrobium+spinosum+DSM+4136T.">Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).</li><li>Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lysine+biosynthesis:+an+evolving+antibiotic+strategy.">Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy.</a> Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical.">(p)ppGpp: still magical.</a> Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).</li><li>Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+response.">The stringent response.</a> Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Chatterji, D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+stringent+response,+ppGpp+and+starvation+signaling.">Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).</li><li>Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+stringent+response+and+survival.">ppGpp: stringent response and survival.</a> J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).</li><li>Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-UV+stress+in+Salmonella+typhimurium:+4-thiouridine+in+tRNA,+ppGpp,+and+pppGpp+as+components+of+an+adaptive+response.">Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response.</a> J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).</li><li>Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+alarms+and+cell+division+in+Escherichia+coli.">Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).</li><li>Mittenhuber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+evolution+of+genes+encoding+bacterial+(p)+ppGpp+synthetases/hydrolases+(the+Rel,+RelA,+and+SpoT+proteins).">Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins).</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).</li><li>Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+rsh+Gene+from+a+Novosphingobium+sp.+Necessary+for+Quorum-Sensing+Signal+Accumulation.">Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation.</a> J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).</li><li>Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+biochemical+analysis+of+the+diaminopimelate+and+lysine+biosynthesis+pathway+in+Verrucomicrobium+spinosum:+Identification+and+partial+characterization+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+and+UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate+ligase.">Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase.</a> Front. Microbiol. 3, 183 (2012).</li><li>Hudson, A. O., Gir&#242;n, I., Dobson, R. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+(DapL)+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).</li><li>Dobson, R. C. J., Gir &#242;n, I., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L,L-Diaminopimelate+Aminotransferase+from+Chlamydomonas+reinhardtii:+A+Target+for+Algaecide+Development.">L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development.</a> PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).</li><li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+regulation,+modulation,+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+pBAD+promoter.">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutants+of+Escherichia+coli+K-12+with+low+activity+of+the+diaminopimelic+acid+adding+enzyme.">Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme.</a> J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).</li><li>Mavrides, C., Orr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecific+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases+in+Escherichia+coli.">Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli.</a> J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).</li><li>Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+deficient+in+the+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases.">Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases.</a> J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).</li><li>Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispecific+quintet+of+aromatic+aminotransferases+that+overlap+different+biochemical+pathways+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).</li><li>Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+stringent+response+in+the+essential+function+if+the+conserved+bacterial+G+protein+CgtA+in+Vibrio+cholera.">Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).</li><li>Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+DNA+cloning+system+for+Gram-negative+bacteria:+construction+of+a+gene+bank+of+Rhizobium+meliloti.">Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).</li><li>Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+enzymatic+characterization+of+a+novel+&#946;-1,6-glucosidase+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and enzymatic characterization of a novel &#946;-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae.</a> J Biosci Bioeng. , (2015).</li><li>Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+ALD1+in+activation+of+local+and+systemic+defenses+in+Arabidopsis.">A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis.</a> Plant J. 40, 200-212 (2004).</li><li>Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+prediction+of+protein+function.">Automatic prediction of protein function.</a> Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).</li><li>Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+the+Arabidopsis+pds1+mutation+with+the+gene+encoding+p-Hyrdoxyphenylpyruvate+dioxygenase.">Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase.</a> Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).</li><li>Mohler, W. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+cell+fusion+analyzed+by+lacZ+complementation+in+mammalian+cells.">Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).</li></ol>

Molti dei corsi che sono parte integrante del Biotecnologie e Bioscienze molecolare curriculum presso il Rochester Institute of Technology hanno una componente di laboratorio in aggiunta alla quota lezione del corso. Il piano di studi per l&#39;anno accademico 2014-2015 contiene un totale di 48 corsi, 29 dei quali contengono una componente di laboratorio che rappresentano circa il 60%. Un tale corso è Fondamenti di piante Biochimica e Patologia (FPBP), una conferenza / corso di laboratorio miscelati e Bioseparations: p...

complementazione funzionale nel contesto di chiarire la funzione (s) / ruolo (s) di un gene viene definita come la capacità di un particolare omologo o gene orthologous ripristinare un particolare mutante con un fenotipo osservabile allo stato wild-type quando l&#39;omologa o gene orthologous è introdotto in cis o trans in secondo piano mutante. Questa tecnica è stata ampiamente usata per isolare e identificare la funzione (s) / ruolo (s) di molti geni. Un esempio particolare è l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di orotidina-5-fosfato decarbossilasi da Candida albicans utilizzando il mutante URA3 di S. cerevisiae e il mutante pyrF di E. coli. 1 Gli autori hanno usato questa tecnica per chiarire la funzione dei geni che sono coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi, peptidoglicano e la risposta rigorosi nei loro programmi di ricerca e hanno incorporato questa tecnica nei loro programmi di insegnamento in Biotechnology e Bioscience Molecolare (BMB) programma al Rochester Institute of Technology (RIT). Gli autori insegnano Fondamenti di Biochimica delle piante / Pathology (FPBP) (Hudson) e Bioseparations: principi e le pratiche (BPP) (Hudson / Savka), due corsi di base di divisione superiore di laboratorio elettiva nel programma BMB al RIT. Dal momento che alcuni degli argomenti che vengono discussi nei corsi sono affiliati con i loro interessi di ricerca, gli autori hanno incorporato molte delle tecniche e strumenti sperimentali che vengono utilizzati nei rispettivi programmi di ricerca in questi due corsi di laboratorio-based. Un esempio è complementazione funzionale come un esercizio di laboratorio per rinforzare i materiali delle lezioni relative al metabolismo degli aminoacidi da piante, peptidoglicano e la stringente metabolismo risposta da batteri. Tre dei percorsi di aminoacidi dalle piante che sono discussi nel corso FPBB sono quello della lisina (LYS), la tirosina(Tyr) e fenilalanina (phe). Il percorso lys è evidenziata in corso per l&#39;importanza degli aminoacidi come un amminoacido essenziale per tutti gli animali in particolare gli esseri umani poiché gli animali non hanno la macchina genetica di sintetizzare lys de novo. Inoltre, è stato recentemente scoperto che le piante utilizzano un percorso per la sintesi di lys che è significativamente diversa da quella dei batteri. Questa scoperta è stata parzialmente facilitato da complementazione funzionale del E. coli diaminopimelate (DAP) mutanti utilizzando un gene che codifica l&#39;enzima L, L-diaminopimelate aminotransferasi (DapL) dalla pianta modello Arabidopsis thaliana. 2 I percorsi varianti per la sintesi del lys attraverso la diaminopimelate intermedi sono mostrati in Figura 1. Oltre , la sintesi di lys facilita attraverso l&#39;aspartato derivato famiglia di amminoacidi che è altamente regolata. 3 Oltre alla loro importanza in synt proteineESI, i percorsi per tyr e phe sono evidenziate data la loro importanza nel servire come composti precursori per l&#39;anabolismo di composti fenilpropanoidi prevede la sintesi di composti difesa delle piante quali:. alcaloidi, lignine, flavonoidi, isoflavoni, acido idrossicinnamico tra gli altri 4 Il tyr e percorsi phe sono state evidenziate anche per mostrare la differenza tra l&#39;impianto e percorsi di anabolizzanti batteriche. Nei batteri, l&#39;aminotransferasi tirosina (TyrB) è coinvolto nella anabolismo dei due amminoacidi, che nelle piante, l&#39;enzima è principalmente coinvolto nel catabolismo di tyr e phe e non è coinvolta nella anabolismo di questi aminoacidi. (Figura 2). 4 Le differenze tra Gram positivi e Gram negativi per quanto riguarda la struttura del peptidoglicano (PG) sono evidenziati nel corso FPBP. Il PG dei batteri Gram negativi è di interesse rispetto patologia vegetale in base al fatto che la maggior partepatogeni delle piante sono Gram negativi. Una recente revisione per quanto riguarda i primi 10 batteriche fito-patogeni ha rivelato che tutti sono Gram-negativi. I batteri erano dalla generi:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya e Pectobacterium 5 Una delle differenze chimiche confrontando lo stelo PG di batteri Gram positivi negativi e Gram è la differenza tra la reticolazione amminico acidi di entrambi i tipi. Il primo scatto di tale diverso reticolazione PG si verifica nella fase citoplasmatica di PG anabolismo ed è facilitata dall&#39;enzima UDP N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (mûre) (Figura 3A). Mure catalizza l&#39;aggiunta di un particolare composto diammina in terza posizione dell&#39;asta peptide. 6 Nella maggior parte dei batteri Gram negativi, i lys penultimo precursore, meso -diaminopimelate ( <em&gt; m -DAP) funge reticolazione aminoacidi e lys serve lo stesso ruolo nel PG della maggior parte dei batteri Gram-positivi (Figura 3B). 7 Questo è dovuto al fatto che sia m -DAP e lys possiedono due ammina gruppi e sono in grado di formare due legami peptidici per stelo peptide cross-linking. Nei Bioseparations: Principles and Practices corso (BPP), le differenze tra i sistemi aperti e chiusi per la coltivazione di batteri e come nutriente livelli cambierà in modo significativo in entrambi i sistemi a causa di cambiamenti ambientali sono discussi. Questi eventi sono legati a cambiamenti normativi chiamato &quot;spostamento verso il basso&quot; o &quot;Shift up&quot; attivati ​​da fame o un adeguato apporto di aminoacidi o di energia. La risposta &quot;scalare&quot; può verificarsi quando una coltura batterica viene trasferito da un supporto ricco e complesso ad un mezzo chimicamente definito con una singola fonte di carbonio. Questo cambiamento nell&#39;ambiente porta alla rapida Cessazione della sintesi tRNA e rRNA. Questa cessazione comporta la mancanza di ribosomi, proteine ​​e la sintesi del DNA, anche se la biosintesi degli amminoacidi sono upregulated. Dopo la risposta &quot;scalare&quot;, i ribosomi esistenti siano utilizzati per produrre nuovi enzimi per sintetizzare gli amminoacidi non disponibili a medio o ambiente. Dopo un periodo di tempo, la sintesi rRNA e nuovi ribosomi sono assemblati e la popolazione di cellule batteriche comincia a crescere anche se ad un tasso ridotto. Il corso degli eventi è denominata &quot;risposta stringente&quot; o &quot;controllo rigoroso&quot; ed è un esempio di regolazione cellulare globale e può essere pensato come un meccanismo per la regolazione macchine biosintetica della cellula per compensare la disponibilità dei substrati necessari e fabbisogno energetico . 8 la risposta rigorosa consente quindi di batteri di rispondere rapidamente ai flussi di nutrienti nell&#39;ambiente e contribuisce e ENHANCES la capacità dei batteri di competere in ambienti che possono cambiare rapidamente quanto riguarda nutrienti eo disponibilità di substrato. 8-9 La risposta stringente ha un ruolo fondamentale nel espressione genica quando la disponibilità di aminoacidi, carbonio, azoto, fosfato e acidi grassi sono limitati. 8,10-14 Questa risposta stringente è coordinata da due nucleotidi, guanosina tetrafosfato (ppGpp) e guanosina pentafosfato (pppGpp) comunemente indicata insieme come il alarmone (p) ppGpp. Ad esempio, quando gli amminoacidi sono limitati-che può portare ad un collo di bottiglia di proteine ​​sintesi-la alarmone, guanosina 3,5- (bis) pirofosfato (ppGpp), derivato da anabolismo di guanosina difosfato 3-5-trifosfato (pppGpp) accumula nella cella. La variazione del livello di (p) ppGpp è coinvolto nella espressione dei geni che regolano la risposta a superare la mancanza di substrati per l&#39;ambiente che sono direttamente coinvolti nella crescita cellulare e SVILUPPOt. Due dei geni che sono coinvolti in questo processo sono chiamati RELA e Spot. RelA è un (p) ppGpp sintetasi ribosoma-associata che è coinvolto nella risposta all&#39;accumulo di tRNA caricate che è il risultato di limitazione aminoacidi. funzioni di punto come un bifunzionale (p) ppGpp sintetasi e idrolasi. L&#39;attività sintetasi di spot è coinvolto nella risposta alla mancanza di carbonio e acido grasso inedia. 8 Le omologhi RelA / SPOT sono diffusi nelle piante e batteri e sono indicati come Rsh per R ELA / S pot h omologs. 8,10 -12,16 un recente manoscritto dimostrato che vi è una specifica proteina Rsh coinvolto nella sintesi di questi alarmones dal batterio Novosphingobium sp Rr 2-17. 17 Qui vi presentiamo quattro vie biochimiche impastoiati ai saggi di complementazione funzionale. I saggi di complementazione delineati in questo manoscritto fornisce una strada per explminerale di impiegare questo test in vivo come un mezzo per identificare e caratterizzare o enzimi che sono previsti ad avere funzione sconosciuta / putativa (s) o come strumenti didattici per integrare l&#39;insegnamento di vie biochimiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">E. coli mutants</td>
			<td style="width:372px;">Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652082</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature controlled incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Agar</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>22700025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12795084</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M9 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63011</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Medium</td>
			<td>Fisher Scientfic&#160;</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diaminopimelate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92591</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0376</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenlylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gylcerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracyline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10342-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11708-013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15224-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Dh5-alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td align="right">18258012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Top10</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>C4040-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET100D/topo vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCR2.1 Vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K2030-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways

Saggio complementazione funzionale (FCA) è un test in vivo che è ampiamente utilizzato per chiarire la funzione / ruolo dei geni / enzimi. Questa tecnica è molto comune in biochimica, genetica e molte altre discipline. Una panoramica completa della tecnica per integrare l&#39;insegnamento delle vie biochimiche inerenti agli aminoacidi, peptidoglicano e la risposta stringente batterica è riportato in questo manoscritto. Due cDNAs dalla pianta modello thaliana organismo Arabidopsis che sono coinvolti nel metabolismo della lisina (L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL) e tirosina aminotransferasi (tyrB) coinvolti nel metabolismo di tirosina e fenilalanina sono evidenziate. Inoltre, il peptidoglicano batterico pathway anabolizzante è evidenziato attraverso l&#39;analisi del -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (MURE) gene UDP N dal batterio Verrucomicrobium spinosum coinvolti nella croce-libreria di peptidoglicano. La risposta stringente batterica è riportato anche attraverso l&#39;analisi del rsh (R ELA / s pot h Omolog) gene bifunzionale responsabile di un fenotipo iper-mucoide nel sp batterio Novosphingobium. Quattro esempi di FCA sono presentati. Nel video si concentrerà su tre di loro, vale a dire lisina, peptidoglicano e la risposta stringente.

I ceppi batterici che sono impiegati nelle varie analisi di complementazione funzionali sono riportati in Tabella 2. Analisi Funzionale complementazione: L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL) Il E. coli doppio mutante AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) ospita una mutazione nel gene Dape e una delezione completa del gene ...

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Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

La convalida delle attività enzimatiche coinvolte in processi biochimici può essere chiarita utilizzando l&#39;analisi complementazione funzionale (FCA). Descritto in questo manoscritto è il saggio FCA dimostrare l&#39;attività enzimatica degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli amminoacidi, risposta stringente batterica e batterica biosintesi peptidoglicano.

Analisi Funzionale complementazione (FCA): Un esercizio laboratorio progettato e realizzato per integrare la didattica di biochimiche Pathways

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

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