Name: functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

AOHとMASは、サポートのための科学技術のロチェスター研究所の生命科学のトーマスH. Gosnell学校の大学を認めています。この作品は、AOH MCB-1120541に米国国立科学財団（NSF）賞によって部分的にサポートされていました。

注：著者は興味を持っている個人のための教育目的のための機能的相補性分析の組み込みを容易にするために、細菌株および組換えプラスミドを提供するために喜んでいます。機能的相補性実験を容易にするために使用したプラスミドは、表1に記載されています。 1.機能補完のためのプラスミドの構築を<ol><li>機能的相補性のためのジアミノピメリン酸ア?...

<ol>
	<li>Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Candida+albicans+gene+for+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+by+complementation+of+S.+cerevisiae+ura3+and+E.+coli+pyrF+mutations.">Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations.</a> Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).</li><li>Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+defines+a+novel+variant+of+the+lysine+biosynthesis+pathway+in+plants.">An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants.</a> Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).</li><li>Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate-derived+amino+acid+biosynthesis+in+Arabidopsis+thaliana.">Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana.</a> The Arabidopsis Book. , (2009).</li><li>Prabhu, P., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+partial+characterization+of+an+L-Tyrosine+aminotransferase+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana.</a> Biochemistry Research International. , 549572 (2010).</li><li>Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+pathogenic+bacteria+in+molecular+pathology.">Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).</li><li>McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate:+meso-2,6-diaminopimelate+ligase+(MurE)+from+Verrucomicrobium+spinosum+DSM+4136T.">Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).</li><li>Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lysine+biosynthesis:+an+evolving+antibiotic+strategy.">Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy.</a> Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical.">(p)ppGpp: still magical.</a> Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).</li><li>Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+response.">The stringent response.</a> Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Chatterji, D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+stringent+response,+ppGpp+and+starvation+signaling.">Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).</li><li>Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+stringent+response+and+survival.">ppGpp: stringent response and survival.</a> J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).</li><li>Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-UV+stress+in+Salmonella+typhimurium:+4-thiouridine+in+tRNA,+ppGpp,+and+pppGpp+as+components+of+an+adaptive+response.">Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response.</a> J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).</li><li>Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+alarms+and+cell+division+in+Escherichia+coli.">Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).</li><li>Mittenhuber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+evolution+of+genes+encoding+bacterial+(p)+ppGpp+synthetases/hydrolases+(the+Rel,+RelA,+and+SpoT+proteins).">Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins).</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).</li><li>Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+rsh+Gene+from+a+Novosphingobium+sp.+Necessary+for+Quorum-Sensing+Signal+Accumulation.">Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation.</a> J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).</li><li>Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+biochemical+analysis+of+the+diaminopimelate+and+lysine+biosynthesis+pathway+in+Verrucomicrobium+spinosum:+Identification+and+partial+characterization+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+and+UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate+ligase.">Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase.</a> Front. Microbiol. 3, 183 (2012).</li><li>Hudson, A. O., Gir&#242;n, I., Dobson, R. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+(DapL)+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).</li><li>Dobson, R. C. J., Gir &#242;n, I., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L,L-Diaminopimelate+Aminotransferase+from+Chlamydomonas+reinhardtii:+A+Target+for+Algaecide+Development.">L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development.</a> PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).</li><li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+regulation,+modulation,+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+pBAD+promoter.">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutants+of+Escherichia+coli+K-12+with+low+activity+of+the+diaminopimelic+acid+adding+enzyme.">Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme.</a> J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).</li><li>Mavrides, C., Orr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecific+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases+in+Escherichia+coli.">Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli.</a> J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).</li><li>Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+deficient+in+the+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases.">Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases.</a> J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).</li><li>Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispecific+quintet+of+aromatic+aminotransferases+that+overlap+different+biochemical+pathways+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).</li><li>Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+stringent+response+in+the+essential+function+if+the+conserved+bacterial+G+protein+CgtA+in+Vibrio+cholera.">Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).</li><li>Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+DNA+cloning+system+for+Gram-negative+bacteria:+construction+of+a+gene+bank+of+Rhizobium+meliloti.">Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).</li><li>Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+enzymatic+characterization+of+a+novel+&#946;-1,6-glucosidase+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and enzymatic characterization of a novel &#946;-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae.</a> J Biosci Bioeng. , (2015).</li><li>Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+ALD1+in+activation+of+local+and+systemic+defenses+in+Arabidopsis.">A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis.</a> Plant J. 40, 200-212 (2004).</li><li>Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+prediction+of+protein+function.">Automatic prediction of protein function.</a> Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).</li><li>Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+the+Arabidopsis+pds1+mutation+with+the+gene+encoding+p-Hyrdoxyphenylpyruvate+dioxygenase.">Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase.</a> Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).</li><li>Mohler, W. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+cell+fusion+analyzed+by+lacZ+complementation+in+mammalian+cells.">Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).</li></ol>

ロチェスター工科大学でバイオテクノロジーおよび分子バイオサイエンスのカリキュラムに不可欠なコースの多くは、当然の講義部分に加えて、研究室のコンポーネントを持っています。学年2014-2015ためのカリキュラムは、約60％を占める研究室のコンポーネントが含まれている29そのうち48コースの合計が含まれています。そのようなコースは、植物生化学・病理学（FPBP）、ブレンド講義/?...

遺伝子の機能を解明するの文脈で機能的相補性（S）/役割（複数可）は、相同野生型状態を観察可能な表現型を有する特定の変異体を回復するために特定の相同またはオーソロガス遺伝子の能力として定義されますまたはオルソロガス遺伝子変異バックグラウンドにシスまたはトランスで導入されます。この技術は、広く分離し、機能（複数可）は、多くの遺伝子/役割（複数可）を識別するために使用されてきました。 1つの特定の例は、SのURA3変異体を使用して、 カンジダ・アルビカンスからオロチジン-5-リン酸脱炭酸酵素の単離および同定でありますcerevisiaeおよびE.ののpyrF変異体大腸菌 。1著者は、アミノ酸、ペプチドグリカンとその研究プログラムにおける緊縮応答の代謝に関与し、Bでの教育プログラムにこの技術を組み込んだ遺伝子の機能を解明するために、この技術を使用していますiotechnologyおよび分子バイオサイエンス（BMB）ロチェスター工科大学（RIT）でのプログラム。 原則と慣行（BPP）（ハドソン/ Savka）、RITでBMBのプログラムで2つの上部の分割選択科目の研究室ベースのコース：著者らは、植物生化学/病理学（FPBP）（ハドソン）とバイオセパレーションの基礎を教えます。コー​​スで議論されたトピックのいくつかは、彼らの研​​究分野で提携しているので、著者らは、これらの2実験室ベースのコースに、それぞれの研究プログラムで使用されている技術と実験的なツールの多くが組み込まれています。その一例は、植物、ペプチドグリカンや細菌からの緊縮応答代謝から酸代謝をアミノ酸に関連する講義資料を強化するために、実験室の練習として機能的相補性です。 FPBBコースで議論されている植物由来のアミノ酸経路のうちの3つがあることリシン（リジン）の、チロシン（tyrで）とフェニルアラニン（Pheで）。動物がLys デノボを合成する遺伝子機構を欠いているため、Lysの経路があるため、すべての動物、特にヒトのための必須アミノ酸などのアミノ酸の重要性のコースで強調表示されます。また、最近、植物は細菌のものとは大きく異なるリジンの合成経路を用いることが発見されました。この発見は、部分的にEの機能的相補性によって促進されましたコリジアミノピメリン酸（DAP）のモデル植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの酵素L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）をコードする遺伝子を用いて、変異体2、中間ジアミノピメリン介してリジンの合成のための変形経路は、 図1に示されている。また、リジンの合成は、高度に調節されているアミノ酸のアスパラギン酸由来のファミリーを介して容易にする。3タンパク質SYNTにおけるそれらの重要性に加えてhesisは、TyrおよびPheのための経路はフェニル化合物の同化作用のための前駆体化合物のような植物の防御化合物の合成関与となる中で、その重要性を考慮強調表示されています：アルカロイド、リグニン、フラボノイド、イソフラボノイド、とりわけヒドロキシ酸を4 TyrでおよびPhe経路は、植物や細菌の同化経路の違いを示すために強調されています。植物において、酵素は、TyrおよびPheへの異化作用における主に関与し、これらのアミノ酸の同化に関与していないのに対し、細菌は、酵素チロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）は、両方のアミノ酸の同化作用に関与しています。 （ 図2）。4 ペプチドグリカンの構造に関するグラム陽性およびグラム陰性菌（PG）との相違点は、FPBPコースで強調表示されます。グラム陰性菌のPGは、そのほとんど事実にに基づいて、植物病理学に関する関心があります植物病原体は、グラム陰性です。トップ10の細菌フィト病原体に関する最近のレビューは、すべてのグラム陰性であることを明らかにしました。細菌は属からのものであった： シュードモナス 、 ラルストニア 、 アグロバクテリウム 、 キサントモナス 、 エルウィニア 、Xylella、DickeyaとPectobacterium化学違いの5つのグラム陰性およびグラム陽性菌のPGステムを比較する架橋アミノ酸の差があります両方のタイプの酸です。 PGの異なる架橋のための最初のステップは、PG同化の細胞質工程で起こり、酵素UDP- N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（のMurE）によって促進されます（ 図3A）。 MurEはペプチドステムの3番目の位置における特定のジアミン化合物の付加を触媒する大部分のグラム陰性細菌で6、最後から二番目のLysの前駆体、 メソ -diaminopimelate（ <e架橋アミノ酸およびLysは、ほとんどのグラム陽性菌のPG（ 図3B）で同じ役割を果たすようメートル&gt;メートルの-dap）が提供しています。7これが原因メートルの -dapおよびLys両方が2つのアミンを保有するという事実によるものであり、グループとは、ペプチド幹架橋のための2つのペプチド結合を形成することができます。 バイオセパレーションの場合：原則と実践（BPP）もちろん、細菌の培養のためのオープンとクローズドシステムの違いとどのように栄養のレベルは、環境の変化が議論されていると、両方のシステムで大幅に変更されます。これらのイベントは、「シフトダウン」や飢餓やアミノ酸やエネルギーの十分な供給を契機「シフトアップ」と呼ばれる規制の変更にリンクされています。細菌培養物を単一炭素源と化学的に定義された培地に豊かで複雑な媒体から転送されたときに、「シフトダウン」応答が発生する可能性があります。環境の変化が急速cessaにつながりますtRNAとrRNAの合成化。アミノ酸の生合成をアップレギュレートされていてもリボソーム、タンパク質およびDNA合成の欠如でこの停止をもたらします。 「ダウンシフト」の応答に続いて、既存のリボソーム培地または環境で利用できなくなったアミノ酸を合成する新しい酵素を生成するために使用されます。一定期間後、rRNAの合成と新しいリボソームが組み立てられ、細菌細胞の集団を減少した速度であるが成長し始めます。イベントのコースは「 緊縮応答」または「 ストコントロール」と呼ばれ 、世界的な細胞制御の一例であり、必要な基質およびエネルギー需要の利用可能性を補償するために、細胞の生合成機構を調整する機構と考えることができますされています8緊縮応答は、このような環境での栄養素のフラックスに迅速に対応するために、細菌を可能にし、貢献し、ENH栄養素およびまたは基板の可用性に関して迅速に変更することができる環境で競争する細菌の能力をances。8-9 緊縮応答は、アミノ酸、炭素、窒素、リン酸、および脂肪酸の利用が制限されている遺伝子発現において重要な役割を持っている。8,10-14この緊縮応答は、2個のヌクレオチド、グアノシン四リン酸（ppGpp）とグアノシンによって調整されています五（pppGpp）は、一般的にalarmone（P）ppGppとして一緒に呼ばれます。例えば、アミノ酸が限ら-れているタンパク質合成-alarmone、グアノシンのボトルネックにつながる可能性が3,5-（ビス）グアノシンの同化由来ピロリン酸（ppGpp）、3-二リン酸5 - 三リン酸（pppGpp）が蓄積セルインチ（p）ppGppレベルの変化は、直接、細胞増殖及びdevelopmenに関与している環境での基質の不足を克服するために応答を調​​節する遺伝子の発現に関与しますトン。このプロセスに関与する遺伝子のうちの2つがRELAとスポットと呼ばれています。 RelAのアミノ酸の制限の結果である非荷電tRNAの蓄積に応答に関与するリボソーム関連（p）ppGpp合成酵素です。二官能性（P）ppGpp合成酵素と加水分解酵素などのスポット機能します。スポットの合成酵素活性は、炭素および脂肪酸飢餓の欠如に応答に関与している。8のRelA /スポットホモログは、植物や細菌に広く分布しており、R ELA / Sポット時間 omologsのためのrshと呼ばれている。8,10 -12,16最近の原稿は、細菌Novosphingobium属 Rrを2月17日からこれらのalarmonesの合成に関与する特定のrshタンパク質が存在することを示した。17 ここでは、機能的相補アッセイにつなが4生化学的経路を提示します。この原稿で概説相補アッセイは正しくありませんするための手段を提供します鉱石は識別し、または生化学的経路の授業を補完するために、未知/推定機能（複数可）または教育ツールとしてを有することが予測される酵素を特徴づけるための手段として、このインビボアッセイを使用します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">E. coli mutants</td>
			<td style="width:372px;">Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652082</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature controlled incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Agar</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>22700025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12795084</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M9 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63011</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Medium</td>
			<td>Fisher Scientfic&#160;</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diaminopimelate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92591</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0376</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenlylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gylcerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracyline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10342-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11708-013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15224-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Dh5-alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td align="right">18258012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Top10</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>C4040-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET100D/topo vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCR2.1 Vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K2030-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways

機能的相補性アッセイ（FCA）が広く遺伝子/酵素の機能/役割を解明するために使用されるin vivoアッセイです。この技術は、生化学、遺伝学および他の多くの分野で非常に一般的です。酸、ペプチドグリカンや細菌の緊縮応答は、この原稿で報告されたアミノ酸に関連する生化学的経路の教育を補完する技術の包括的な概観。リジン（L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL）およびチロシンとフェニルアラニンの代謝に関与するチロシンアミノトランスフェラーゼ（なtyrB）の代謝に関与しているモデル植物生物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの2つのcDNAが強調されている。また、細菌のペプチドグリカン同化経路は、クロスに関与する細菌Verrucomicrobium有棘からUDP-N -acetylmuramoyl -L-アラニル-D-グルタメートメソ -2,6-ジアミノピメリン酸リガーゼ（牟礼）遺伝子を解析して強調表示されていますペプチドグリカンの-linking。細菌の緊縮応答はまた、RSH（R ELA / sのポット時間 omolog）細菌Novosphingobium属におけるハイパームコイド表現型の原因二官能性遺伝子の解析を通じて報告される。FCAの4つの例が提示されています。ビデオは、それらの3、すなわちリジン、ペプチドグリカンと緊縮応答に焦点を当てます。

様々な機能相補分析に使用される菌株は、 表2に記載されています。 機能的相補性解析：L、L-ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（DAPL） E.大腸菌二重変異体AOH1（ΔDAPD :: Kan2、dapE6）は DAPE遺伝子の変異とDAPD遺伝子の完全な欠失（ <str...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

生化学的経路に関与する酵素活性の検証は、機能的相補性分析（FCA）を用いて明らかにすることができます。アミノ酸は、細菌の緊縮応答および細菌ペプチドグリカン生合成の代謝に関与する酵素の酵素活性を示すFCAアッセイは本稿で説明します。

機能的相補性分析（FCA）：生化学的経路の授業を補足するように設計および実装実験演習

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

レンズゼブラフィッシュでの移植とアイ変異体の解析への応用

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

二分子蛍光相補

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

運動時のエネルギーシステムの貢献を決定する

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

教育実習でラクターゼ酵素活性の測定

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

学部の教育研究所の酵母エストロゲンの画面に最適化されたを使用して個人的な心配プロダクトのエストロゲンのリガンドを検出

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...