Name: functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

AOH og MAS erkjenner College of Science og Thomas H. Gosnell School of Life Sciences ved Rochester Institute of Technology for støtte. Dette arbeidet ble støttet delvis av United States National Science Foundation (NSF) award til AOH MCB-1120541.

MERK: Forfatterne er villige til å gi bakteriestammer og rekombinante plasmider å lette inkorporering av funksjonell komplemente analyse for undervisningsformål for personer som er interessert. De plasmider som ble brukt for å lette funksjonelle komplemente eksperimenter er oppført i Tabell 1. 1. Bygging av plasmider for Funksjonell Komplemente <ol><li> Kloning av Diaminopimelate aminotransferase (dapL) for Funksjonell Komplemente. <ol><li> Forsterke dapL åpen lesera...

<ol>
	<li>Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Candida+albicans+gene+for+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+by+complementation+of+S.+cerevisiae+ura3+and+E.+coli+pyrF+mutations.">Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations.</a> Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).</li><li>Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+defines+a+novel+variant+of+the+lysine+biosynthesis+pathway+in+plants.">An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants.</a> Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).</li><li>Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate-derived+amino+acid+biosynthesis+in+Arabidopsis+thaliana.">Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana.</a> The Arabidopsis Book. , (2009).</li><li>Prabhu, P., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+partial+characterization+of+an+L-Tyrosine+aminotransferase+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana.</a> Biochemistry Research International. , 549572 (2010).</li><li>Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+pathogenic+bacteria+in+molecular+pathology.">Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).</li><li>McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate:+meso-2,6-diaminopimelate+ligase+(MurE)+from+Verrucomicrobium+spinosum+DSM+4136T.">Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).</li><li>Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lysine+biosynthesis:+an+evolving+antibiotic+strategy.">Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy.</a> Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical.">(p)ppGpp: still magical.</a> Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).</li><li>Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+response.">The stringent response.</a> Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Chatterji, D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+stringent+response,+ppGpp+and+starvation+signaling.">Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).</li><li>Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+stringent+response+and+survival.">ppGpp: stringent response and survival.</a> J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).</li><li>Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-UV+stress+in+Salmonella+typhimurium:+4-thiouridine+in+tRNA,+ppGpp,+and+pppGpp+as+components+of+an+adaptive+response.">Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response.</a> J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).</li><li>Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+alarms+and+cell+division+in+Escherichia+coli.">Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).</li><li>Mittenhuber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+evolution+of+genes+encoding+bacterial+(p)+ppGpp+synthetases/hydrolases+(the+Rel,+RelA,+and+SpoT+proteins).">Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins).</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).</li><li>Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+rsh+Gene+from+a+Novosphingobium+sp.+Necessary+for+Quorum-Sensing+Signal+Accumulation.">Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation.</a> J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).</li><li>Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+biochemical+analysis+of+the+diaminopimelate+and+lysine+biosynthesis+pathway+in+Verrucomicrobium+spinosum:+Identification+and+partial+characterization+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+and+UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate+ligase.">Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase.</a> Front. Microbiol. 3, 183 (2012).</li><li>Hudson, A. O., Gir&#242;n, I., Dobson, R. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+(DapL)+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).</li><li>Dobson, R. C. J., Gir &#242;n, I., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L,L-Diaminopimelate+Aminotransferase+from+Chlamydomonas+reinhardtii:+A+Target+for+Algaecide+Development.">L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development.</a> PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).</li><li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+regulation,+modulation,+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+pBAD+promoter.">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutants+of+Escherichia+coli+K-12+with+low+activity+of+the+diaminopimelic+acid+adding+enzyme.">Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme.</a> J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).</li><li>Mavrides, C., Orr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecific+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases+in+Escherichia+coli.">Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli.</a> J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).</li><li>Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+deficient+in+the+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases.">Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases.</a> J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).</li><li>Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispecific+quintet+of+aromatic+aminotransferases+that+overlap+different+biochemical+pathways+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).</li><li>Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+stringent+response+in+the+essential+function+if+the+conserved+bacterial+G+protein+CgtA+in+Vibrio+cholera.">Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).</li><li>Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+DNA+cloning+system+for+Gram-negative+bacteria:+construction+of+a+gene+bank+of+Rhizobium+meliloti.">Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).</li><li>Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+enzymatic+characterization+of+a+novel+&#946;-1,6-glucosidase+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and enzymatic characterization of a novel &#946;-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae.</a> J Biosci Bioeng. , (2015).</li><li>Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+ALD1+in+activation+of+local+and+systemic+defenses+in+Arabidopsis.">A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis.</a> Plant J. 40, 200-212 (2004).</li><li>Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+prediction+of+protein+function.">Automatic prediction of protein function.</a> Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).</li><li>Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+the+Arabidopsis+pds1+mutation+with+the+gene+encoding+p-Hyrdoxyphenylpyruvate+dioxygenase.">Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase.</a> Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).</li><li>Mohler, W. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+cell+fusion+analyzed+by+lacZ+complementation+in+mammalian+cells.">Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).</li></ol>

Mange av kursene som er en integrert del av bioteknologi og molekylær biovitenskap pensum ved Rochester Institute of Technology har et laboratorium komponent i tillegg til foredrag del av kurset. Læreplanen for studieåret 2014-2015 inneholder totalt 48 kurs, 29 av dem inneholder et laboratorium komponent som representerer ca 60%. Et slikt kurs er Fundamentals of Plant biokjemi og patologi (FPBP), en blandet forelesning / laboratoriekurset og Bioseparations: Prinsipper og praksis (BPP), et laboratorium basert kurs. </...

Funksjonell komplementering i sammenheng med å belyse funksjonen (e) / rolle (r) av et gen som er definert som evnen til en spesiell homologt eller ortologe gen for å gjenopprette en bestemt mutant med en fenotypen til villtype-tilstand når det homologe eller ortologe genet blir innført i cis eller trans til det mutante bakgrunnen. Denne teknikken har blitt mye brukt til å isolere og identifisere funksjonen (e) / rolle (r) av mange gener. Et spesielt eksempel er isolering og identifisering av orotidine-5-fosfat dekarboksylase fra Candida albicans ved hjelp av ura3-mutant av S. cerevisiae og pyrF mutant av E. coli. 1 Forfatterne har brukt denne teknikken for å belyse funksjon av gener som er involvert i metabolismen av aminosyrer, peptidoglykan og strengere reaksjon i sine forskningsprogrammer og har innarbeidet denne teknikken i sine undervisningsopplegg i Biotechnology og molekylær biovitenskap (BMB) program ved Rochester Institute of Technology (RIT). Forfatterne lære grunnleggende av Plant biokjemi / patologi (FPBP) (Hudson) og Bioseparations: Prinsipper og praksis (BPP) (Hudson / Savka), to øverste divisjon valgfag laboratoriebaserte kurs i BMB-programmet ved RIT. Siden noen av temaene som er omtalt i kursene er tilknyttet deres forskningsinteresser, har forfatterne tatt mange av de teknikker og eksperimentelle verktøy som brukes i sine respektive forskningsprogrammer i disse to laboratoriebaserte kurs. Et slikt eksempel er funksjonell komplementering som et laboratorium oppgave å forsterke kompen materialene knyttet til amino acid metabolism fra planter, peptidoglykan og den strenge responsen metabolismen fra bakterier. Tre av aminosyre trasé fra planter som er omtalt i FPBB kurset er at av lysin (lys), tyrosin(Tyr) og fenylalanin (Phe). Den lys veien er markert i løpet på grunn av viktigheten av aminosyren som en essensiell aminosyre for alle dyr spesielt mennesker siden dyr mangler den genetiske maskineri for å syntetisere lys de novo. I tillegg ble det nylig oppdaget at planter anvender en vei for syntesen av lys som er vesentlig forskjellig fra det av bakterier. Dette funnet ble delvis tilrettelagt av funksjonell komplementering av E. coli diaminopimelate (DAP) mutanter ved hjelp av et gen som koder for enzymet L, L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) fra modellen planten Arabidopsis thaliana. 2 varianten veier for syntese av lys gjennom det mellomliggende diaminopimelate er vist i figur 1. I tillegg , syntesen av lys letter gjennom aspartat avledet familie av aminosyrer som er sterkt regulert. 3. i tillegg til deres viktighet i protein synthesis, trasé for Tyr og Phe er uthevet gitt deres betydning i å tjene som forløperforbindelser for anabolisme av styrene forbindelser involvert syntesen av planteforsvars forbindelser som:. alkaloider, lignins, flavonoider, isoflavonoids, hydroxycinnamic syre blant annet fire Tyr og Phe trasé er også uthevet for å vise forskjellen mellom anlegget og bakterie anabole veier. I bakterier, blir enzymet tyrosin aminotransferase (TyrB) som er involvert i den anabolisme av begge aminosyrer, mens det i planter, er enzymet primært involvert i nedbrytningen av Tyr og Phe, og er ikke involvert i den anabolisme av disse aminosyrer. (Figur 2). 4 Forskjellene mellom Gram positive og Gram negative bakterier om strukturen av peptidoglykan (PG) er uthevet i FPBP kurset. PG av Gram-negative bakterier er av interesse angående plantepatologi basert på det faktum at de flesteplantepatogener er Gram negative. En fersk vurdering av de 10 bakterie phyto-patogener avdekket at alle er Gram negative. Bakteriene var fra slektene:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya og Pectobacterium 5 En av de kjemiske forskjeller ved sammenligning av PG-stammen av Gram-negative og Gram-positive bakterier er differansen mellom tverrbindings amino- syrene med begge typer. Det første trinnet for den annen tverrbinding av PG forekommer i det cytoplasmatiske trinnet med PG anabolisme og lettes ved de enzym UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso-2,6-diaminopimelate ligase (Mure) (Figur 3A). Mure katalyserer tilsetningen av en bestemt diaminforbindelse i tredje posisjon av peptidet stammen. 6 I de fleste Gram-negative bakterier, nest siste lys forløper, meso -diaminopimelate ( <em&gt; m -DAP) tjener som tverrbindings aminosyre og lys tjener samme rolle i PG for de fleste Gram-positive bakterier (figur 3B). 7. Dette skyldes det faktum at både m -DAP og lys eie to amin grupper og er i stand til å danne to peptidbindinger for peptid stilk tverrbinding. I Bioseparations: Principles and Practices (BPP) Selvfølgelig er forskjellene mellom åpne og lukkede systemer for dyrking av bakterier og hvordan nærings nivåer vil endre seg betydelig i begge systemer på grunn av miljøendringer diskutert. Disse hendelsene er knyttet til regulatoriske endringer som kalles en &quot;gire ned&quot; eller &quot;gire opp&quot; utløst av sult eller en tilstrekkelig tilførsel av aminosyrer eller energi. Den &quot;gire ned&quot; respons kan oppstå når en bakteriekultur overføres fra en rik og kompleks medium til et kjemisk definert medium med en enkelt karbonkilde. Denne endringen i miljøet fører til rask cessasjon av tRNA og rRNA syntese. Dette opphøret resulterer i mangel på ribosomer, protein og DNA-syntese, selv om biosyntesen av aminosyrer blir oppregulert. Etter &quot;gire ned&quot; respons, er de eksisterende ribosomene som brukes til å fremstille nye enzymer for å syntetisere aminosyrene som ikke lenger er tilgjengelig i medium eller miljø. Etter en periode av tid, blir rRNA-syntesen og nye ribosomer montert og den populasjon av bakterieceller begynner å vokse selv om ved en redusert hastighet. Hendelsesforløpet er kalt &quot;strenge reaksjon&quot; eller &quot;streng kontroll&quot; og er et eksempel på global mobil forskriften, og kan betraktes som en mekanisme for å justere cellens biosyntetiske maskineri for å kompensere for tilgjengeligheten av de nødvendige underlag og energibehov . 8 strengere reaksjon gjør dermed bakterier å reagere raskt på fluks av næringsstoffer i miljøet og bidrar og ENHAnser evnen av bakterier for å konkurrere i miljøer som kan endre seg raskt med hensyn til næringsstoffer og eller substrat tilgjengelighet. 8-9 Den strenge responsen har en vesentlig rolle i genekspresjon når tilgjengeligheten av aminosyrer, karbon, nitrogen, fosfat og fettsyrer er begrenset. 8,10-14 Denne streng reaksjon er koordinert av to nukleotider, guanosin tetrafosfat (ppGpp) og guanosin pentaphosphate (pppGpp) ofte referert sammen som alarmone (p) ppGpp. Når for eksempel aminosyrer er begrenset, noe som kan føre til en flaskehals i proteinsyntese-the alarmone, guanosin 3,5- (bis) pyrofosfat (ppGpp), avledet fra anabolisme av guanosin 3-difosfat 5-trifosfat (pppGpp) akkumulerer i cellen. Endringen i (p) ppGpp nivå er involvert i ekspresjon av gener som regulerer responsen for å overvinne mangelen på substrater i miljøet som er direkte involvert i cellevekst og utvikling;t. To av gener som er involvert i denne prosessen kalles RELA og Spot. Rela er en ribosom-assosiert (p) ppGpp syntetase som er involvert i responsen til opphopning av uladede tRNA som er et resultat av aminosyren begrensning. Spot fungerer som en bifunksjonell (p) ppGpp syntetase og hydrolase. Den syntetase aktivitet av Spot er involvert i respons på mangel av karbon og fettsyre sult. 8 De RELA / sted homologer er utbredt i planter og bakterier og er referert til som Rsh for R ELA / S POT h omologs. 8,10 -12,16 en fersk manuskript viste at det er en spesifikk Rsh protein som er involvert i syntesen av disse alarmones fra bakterien Novosphingobium sp Rr 2-17. 17 Her presenterer vi fire biokjemiske mekanismer tjoret til de funksjonelle komplemente analyser. Komplemente analyser som er skissert i dette manuskriptet gir en vei å eksplmalm under anvendelse av denne in vivo-analyse som et middel for å identifisere og karakterisere eller enzymer som er forutsagt å ha ukjent / antatte funksjon (er) eller som læreverktøy for å supplere undervisningen av biokjemiske mekanismer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">E. coli mutants</td>
			<td style="width:372px;">Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652082</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature controlled incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Agar</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>22700025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12795084</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M9 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63011</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Medium</td>
			<td>Fisher Scientfic&#160;</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diaminopimelate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92591</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0376</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenlylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gylcerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracyline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10342-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11708-013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15224-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Dh5-alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td align="right">18258012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Top10</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>C4040-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET100D/topo vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCR2.1 Vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K2030-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways

Funksjonell komplementering assay (FCA) er en in vivo-assay som er mye brukt for å belyse funksjonen / rollen til gener / enzymer. Denne teknikken er svært vanlig i biokjemi, genetikk og mange andre disipliner. En omfattende oversikt over teknikken for å supplere undervisningen av biokjemiske mekanismer knyttet til aminosyrer, peptidoglykan og bakteriell strengere reaksjon er rapportert i dette manuskriptet. To cDNA fra modell anlegg organisme Arabidopsis thaliana som er involvert i metabolismen av lysin (L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) og tyrosin aminotransferase (tyrB) som er involvert i metabolismen av tyrosin og fenylalanin er uthevet. I tillegg bakteriell peptidoglykan anabole veien er spesielt markert ved analyse av UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso-2,6-diaminopimelate ligase (Mure) genet fra bakterien Verrucomicrobium spinosum involvert i tver-linking av peptidoglykan. Bakterie strengere reaksjon er også rapportert gjennom analyse av rsh (r ELA / s POT h omolog) bifunksjonell genet er ansvarlig for en hyper-slimaktig fenotype i bakterien Novosphingobium sp. Fire eksempler på FCA presenteres. Videoen vil fokusere på tre av dem, nemlig lysin, peptidoglykan og strengere reaksjon.

Bakteriestammene som er ansatt i de ulike funksjonelle komplemente analyser er oppført i tabell 2. Funksjonell komplemente analyse: L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) E. coli dobbel mutant AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) havner en mutasjon i dapE genet og en fullstendig sletting av DAPD genet (figur 1).</s...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Valideringen av enzymatiske aktiviteter som er involvert i biokjemiske mekanismer kan belyses ved hjelp av funksjonell komplemente analyse (FCA). Er beskrevet i dette manuskriptet er den FCA-analysen viser den enzymatiske aktiviteten av enzymer involvert i metabolismen av aminosyrer, bakteriell strenge reaksjon og bakteriell peptidoglykan biosyntese.

Funksjonell Komplemente Analysis (FCA): En laboratoriearbeid designet og implementert for å supplere Opplæring i biokjemiske mekanismer

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Bestemme Bidrag av energisystemene under trening

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartlegging Bakteriell Funksjonelle nettverk og veier i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Ved hjelp av syntetisk Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flowcytometrisk analyse av bimolecular Fluorescens complementation: En høy gjennomstrømning Kvantitativ metode for å studere protein-protein interaksjon

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolasjon og Funksjonell analyse av Mitokondrier fra dyrkede celler og mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Måle laktase enzymatiske aktiviteten i undervisning Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Oppdage Estrogenic ligander i personlig pleie-produkter bruker en gjær østrogen skjermen optimert for undervisning undervisning laboratoriet

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Laboratoriet protokoll for genetisk Gut innhold analyser av akvatiske Macroinvertebrates bruke gruppe-spesifikke rDNA primere

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...