Name: functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

AOH и MAS признает колледж науки и Томас Х. Госнелл Школа естественных наук в Рочестерского технологического института для поддержки. Эта работа была частично поддержана со стороны США Национального научного фонда (NSF) награду AOH MCB-1120541.

Примечание: Авторы готовы предоставить бактериальные штаммы и рекомбинантные плазмиды с целью содействия включению функционального анализа комплементационной для целей обучения для лиц, которые заинтересованы. Плазмиды , которые были использованы для облегчения проведения функцио...

<ol>
	<li>Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Candida+albicans+gene+for+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+by+complementation+of+S.+cerevisiae+ura3+and+E.+coli+pyrF+mutations.">Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations.</a> Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).</li><li>Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+defines+a+novel+variant+of+the+lysine+biosynthesis+pathway+in+plants.">An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants.</a> Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).</li><li>Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate-derived+amino+acid+biosynthesis+in+Arabidopsis+thaliana.">Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana.</a> The Arabidopsis Book. , (2009).</li><li>Prabhu, P., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+partial+characterization+of+an+L-Tyrosine+aminotransferase+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana.</a> Biochemistry Research International. , 549572 (2010).</li><li>Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+pathogenic+bacteria+in+molecular+pathology.">Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).</li><li>McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate:+meso-2,6-diaminopimelate+ligase+(MurE)+from+Verrucomicrobium+spinosum+DSM+4136T.">Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).</li><li>Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lysine+biosynthesis:+an+evolving+antibiotic+strategy.">Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy.</a> Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical.">(p)ppGpp: still magical.</a> Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).</li><li>Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+response.">The stringent response.</a> Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Chatterji, D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+stringent+response,+ppGpp+and+starvation+signaling.">Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).</li><li>Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+stringent+response+and+survival.">ppGpp: stringent response and survival.</a> J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).</li><li>Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-UV+stress+in+Salmonella+typhimurium:+4-thiouridine+in+tRNA,+ppGpp,+and+pppGpp+as+components+of+an+adaptive+response.">Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response.</a> J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).</li><li>Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+alarms+and+cell+division+in+Escherichia+coli.">Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).</li><li>Mittenhuber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+evolution+of+genes+encoding+bacterial+(p)+ppGpp+synthetases/hydrolases+(the+Rel,+RelA,+and+SpoT+proteins).">Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins).</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).</li><li>Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+rsh+Gene+from+a+Novosphingobium+sp.+Necessary+for+Quorum-Sensing+Signal+Accumulation.">Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation.</a> J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).</li><li>Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+biochemical+analysis+of+the+diaminopimelate+and+lysine+biosynthesis+pathway+in+Verrucomicrobium+spinosum:+Identification+and+partial+characterization+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+and+UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate+ligase.">Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase.</a> Front. Microbiol. 3, 183 (2012).</li><li>Hudson, A. O., Gir&#242;n, I., Dobson, R. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+(DapL)+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).</li><li>Dobson, R. C. J., Gir &#242;n, I., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L,L-Diaminopimelate+Aminotransferase+from+Chlamydomonas+reinhardtii:+A+Target+for+Algaecide+Development.">L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development.</a> PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).</li><li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+regulation,+modulation,+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+pBAD+promoter.">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutants+of+Escherichia+coli+K-12+with+low+activity+of+the+diaminopimelic+acid+adding+enzyme.">Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme.</a> J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).</li><li>Mavrides, C., Orr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecific+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases+in+Escherichia+coli.">Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli.</a> J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).</li><li>Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+deficient+in+the+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases.">Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases.</a> J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).</li><li>Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispecific+quintet+of+aromatic+aminotransferases+that+overlap+different+biochemical+pathways+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).</li><li>Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+stringent+response+in+the+essential+function+if+the+conserved+bacterial+G+protein+CgtA+in+Vibrio+cholera.">Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).</li><li>Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+DNA+cloning+system+for+Gram-negative+bacteria:+construction+of+a+gene+bank+of+Rhizobium+meliloti.">Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).</li><li>Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+enzymatic+characterization+of+a+novel+&#946;-1,6-glucosidase+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and enzymatic characterization of a novel &#946;-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae.</a> J Biosci Bioeng. , (2015).</li><li>Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+ALD1+in+activation+of+local+and+systemic+defenses+in+Arabidopsis.">A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis.</a> Plant J. 40, 200-212 (2004).</li><li>Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+prediction+of+protein+function.">Automatic prediction of protein function.</a> Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).</li><li>Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+the+Arabidopsis+pds1+mutation+with+the+gene+encoding+p-Hyrdoxyphenylpyruvate+dioxygenase.">Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase.</a> Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).</li><li>Mohler, W. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+cell+fusion+analyzed+by+lacZ+complementation+in+mammalian+cells.">Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).</li></ol>

Многие из курсов, которые являются неотъемлемой частью биотехнологии и молекулярной Bioscience учебного плана в Рочестерского технологического института имеют лабораторный компонент в дополнение к лекционной части курса. Учебный план на учебный 2014-2015 год содержит в общей сложности 48 кур?...

Функциональная комплементационный в контексте выяснении функцию (и) / роли (ролей) гена определяется как способность конкретного гомологичные или ортологичными гена для восстановления конкретного мутанта с наблюдаемой фенотипа к состоянию дикого типа, когда гомологичные или ортологичными ген вводят в цис- или транс - в мутантный фоне. Этот метод широко используется для выделения и идентификации функции (ы) / роли (ролей) многих генов. Одним из конкретных примеров является выделение и идентификация оротидин-5-фосфат - декарбоксилазы от Candida Albicans использованием URA3 мутант S. CEREVISIAE и pyrF мутант Е. палочки. 1 Авторы использовали эту технику для выяснения функции генов, которые участвуют в обмене аминокислот, пептидогликана и строгий ответ в своих научно - исследовательских программ и включили эту технику в свои учебные программы в Biotechnology и программы в Рочестерского технологического института (RIT) Молекулярная Bioscience (BMB). Авторы учат Основы биохимии растений / Патология (FPBP) (Hudson) и Bioseparations: Принципы и практика (BPP) (Hudson / Савка), два курса верхнего отдела факультативный лаборатория, базирующаяся в программе BMB ​​на RIT. Так как некоторые из тем, которые обсуждаются в курсах аффилированы с их научными интересами, авторы включили многие из методов и экспериментальных инструментов, которые используются в своих научно-исследовательских программ в этих двух курсов лабораторных основе. Одним из таких примеров является функциональной дополнительности в качестве лабораторного упражнения, чтобы укрепить лекционные материалы, имеющие отношение к метаболизм аминокислот из растений, пептидогликана и строгие реакции метаболизма от бактерий. Три из путей аминокислот из растений, которые обсуждаются в ходе FPBB является то, что лизин (Lys), тирозин(Тир) и фенилаланин (Phe). Лиз путь выделяется в процессе из - за важности аминокислоты в качестве незаменимой аминокислоты для всех животных , особенно у людей , так как животные не имеют генетический механизм для синтеза лиз De Novo. Кроме того, недавно было установлено, что растения используют путь для синтеза лиз, который значительно отличается от бактерий. Это открытие было частично способствовало функциональной комплементации E. палочки диаминопимелатдегидрогеназу (DAP) мутанты с использованием гена , который кодирует фермент L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) от модели завода Резуховидка Таля. 2 от варианта пути синтеза лиз через промежуточный диаминопимелатдегидрогеназу показаны на рисунке 1. Кроме того , синтез лиз облегчает через аспартат полученные семейства аминокислот , которые строго регламентированы. 3 в дополнение к их важности в белковой Synthesis, тропинки для Tyr и Phe выдвинуты на первый план , учитывая их важность в выступающей в качестве исходных соединений для анаболизм фенилпропаноидных соединений , участвующих в синтезе растительных защитных соединений , таких как:. алкалоиды, лигнины, флавоноиды, изофлавоноидов, гидроксикоричной кислоты среди других 4 Тир и фенилаланина пути также подсвечиваться, чтобы показать разницу между растением и бактериальными анаболических путей. У бактерий фермент тирозин-аминотрансферазы (TyrB) участвует в анаболизм обеих аминокислот, в то время как в растениях, фермент в основном участвует в катаболизме Tyr и Phe и не участвует в анаболизм этих аминокислот. (Рисунок 2). 4 Различия между грамположительных и грамотрицательных бактерий относительно структуры пептидогликана (PG), выделены в FPBP конечно. Программатор грам-отрицательных бактерий, представляет интерес в отношении патологии растений основано на тот факт, что большинствовозбудителей болезней растений являются грамотрицательные. Недавний обзор в отношении 10 лучших бактериальных фито-патогенных микроорганизмов показали, что все грамотрицательные. Бактерии из родов:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya и Pectobacterium 5 Одним из химических различий при сравнении ствола PG грамотрицательных и грамположительных бактерий , разница между сшивающего амино- кислоты обоих типов. Первым шагом для этого различного сшиванию PG происходит в цитоплазматической ступени PG анаболизм и облегчается с помощью фермента UDP- N -acetylmuramoyl-L-аланил-D-glutamate- мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигаза (мурэ) (Рисунок 3А). Мурэ катализирует добавление конкретного диамина соединения в третьем положении пептида стебле. 6 В большинстве грамотрицательных бактерий, предпоследний лиз предшественник, мезо -diaminopimelate ( <eм&gt; м -DAP) служит в качестве сшивающего аминокислоту и лиз выполняет ту же роль в PG большинства грамположительных бактерий (фиг.3В). 7 Это связано с тем , что оба м -DAP и Lys имеют два амина групп и способны образовывать две пептидные связи пептидных стволовой сшиванием. В Bioseparations: Принципы и практика (BPP), конечно, различия между открытыми и закрытыми системами для выращивания бактерий и, как уровни питательных веществ существенно изменится в обеих системах из-за изменений окружающей среды обсуждаются. Эти события связаны с регуляторными изменениями называется &quot;сдвиг вниз&quot; или &quot;сдвиг вверх&quot;, вызванная голоданием или достаточный запас аминокислот или энергии. &quot;Сдвиг вниз&quot; реакция может произойти, когда бактериальная культура передается из богатой и сложной среде в химически определенной среде с одним источником углерода. Это изменение в окружающей среде приводит к быстрому CESSAция тРНК и рРНК синтеза. Это приводит к отказу от отсутствия рибосом, синтеза белка и ДНК, даже при том, что биосинтез аминокислот активируемых. После &quot;Сдвиг вниз&quot; ответ, существующие рибосомы используются для производства новых ферментов для синтеза аминокислот, больше не доступны в среде или среде. После некоторого периода времени, синтез рРНК и новые рибосомы собраны и популяция бактериальных клеток начинает расти, хотя по сниженной цене. Ход событий называется &quot;жестким ответом&quot; или &quot;жесткий контроль&quot; и является примером глобальной клеточной регуляции и может рассматриваться в качестве механизма для регулирования биосинтетическую машины ячейки , чтобы компенсировать наличие необходимых субстратов и энергетических потребностей . 8 Строгий ответ , таким образом , позволяет бактериям быстро реагировать на потоки питательных веществ в окружающей среде и способствует и ENHAnces способность бактерий , чтобы конкурировать в условиях , которые могут быстро меняться в отношении питательных веществ и наличия или субстрата. 8-9 Строгий реакция имеет важную роль в экспрессии генов , когда наличие аминокислот, углерода, азота, фосфата и жирных кислот ограничены. 8,10-14 Это жесткие ответ координируется двумя нуклеотидами, гуанозин тетрафосфат (ppGpp) и гуанозина pentaphosphate (pppGpp) обычно называют вместе как alarmone (р) ppGpp. Например, когда аминокислоты с ограниченным, которые могут привести к узким местом в синтеза белка-на alarmone, гуанозин 3,5- (бис) пирофосфат (ppGpp), полученный из анаболизм гуанозин 3-дифосфат 5-трифосфата (pppGpp) накапливает в клетке. Изменение уровня (р) ppGpp участвует в экспрессии генов, которые регулируют реакцию преодолеть отсутствие субстратов в окружающей среде, которые непосредственно вовлечены в рост клеток и РАЗВИТИЕт. Два из генов, которые участвуют в этом процессе, называются Рела и SPOT. RelA является рибосомами, связанный (р) ppGpp синтетазы, который участвует в ответ на накопление тРНК, что является результатом ограничения аминокислоты. Функции SPOT как бифункциональный (р) ppGpp синтетазы и гидролазы. Синтетазы активность SPOT участвует в ответ на отсутствие углерода и жирных кислот голодания. 8 гомологов RelA / SPOT широко распространены в растениях и бактериях и называются Rsh для R ELA / S горшка ч omologs. 8,10 -12,16 Недавно рукопись показал , что существует специфический белок Rsh участвует в синтезе этих alarmones из бактерии Novosphingobium зр Rr 2-17. 17 Здесь мы представляем четыре биохимических путей, привязанными к функциональным комплементационных анализов. Комплементации анализы, описанные в этой рукописи содержится проспект к EXPLруды с использованием этого анализа в естественных условиях в качестве средства идентификации и или характеризующие ферменты, которые предсказаны , чтобы иметь неизвестный / предполагаемую функцию (ы) или в качестве учебно - методических пособий в дополнение к преподаванию биохимических путей.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">E. coli mutants</td>
			<td style="width:372px;">Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652082</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature controlled incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Agar</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>22700025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12795084</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M9 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63011</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Medium</td>
			<td>Fisher Scientfic&#160;</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diaminopimelate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92591</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0376</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenlylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gylcerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracyline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10342-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11708-013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15224-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Dh5-alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td align="right">18258012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Top10</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>C4040-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET100D/topo vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCR2.1 Vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K2030-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways

Функциональный анализ комплементационная (FCA) представляет собой анализ в естественных условиях , который широко используется для выяснения функции / роль генов / ферментов. Этот метод является очень распространенным явлением в области биохимии, генетики и многих других дисциплин. Подробный обзор техники в дополнение к преподаванию биохимических путей, имеющих отношение к аминокислотам, пептидогликана и бактериальная жесткие ответ сообщается в этой рукописи. Два кДНК из модели растительного организма Резуховидка Таля, которые участвуют в обмене веществ лизина (L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) и тирозин - аминотрансферазы (tyrB) , участвующих в обмене тирозина и фенилаланина выдвинуты на первый план. Кроме того, бактериальные пептидогликана анаболический путь выделен через анализ -acetylmuramoyl-L-аланил-D-glutamate- мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигазная (Мюр) гена UDP- N из бактерии Verrucomicrobium Spinosum , участвующих в скрещивании-linking пептидогликана. Бактериальный жесткие реакции также сообщается посредством анализа РСЗ (г ELA / с горшка ч УДОСТОВЕРЕ) бифункциональный ген , ответственный за гипер-слизистый фенотипа бактерии Novosphingobium зр. Четыре примера FCA представлены. Видео будет сосредоточена на трех из них, а именно лизин, пептидогликана и жестким ответом.

Бактериальные штаммы, которые используются в различных функциональных анализах комплементации, перечислены в таблице 2. Функциональный анализ комплементационная: L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) <p...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Проверка достоверности ферментативных активностей, участвующих в биохимических путей, могут быть объяснены с помощью функционального анализа комплементации (FCA). Описанное в этой рукописи является анализ FCA демонстрирующий ферментативную активность ферментов, участвующих в метаболизме аминокислот, бактериальный строгие реакции и бактериального пептидогликана биосинтеза.

Анализ функциональной дополнительности (FCA): A Laboratory Упражнение Разработана и внедрена к дополнению Учение биохимических путей

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Объективы трансплантации в данио рерио и его применение в анализе глаз Мутанты

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Мутагенеза и функционального анализа ионных каналов Heterologously Выраженный в клетках млекопитающих

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Бимолекулярные флуоресценции комплементации

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Определение вклада Energy Systems во время тренировки

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Сопоставление бактериальных функциональных сетей и путей в<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Использование синтетических генетических массивы

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Проточной цитометрии бимолекулярного флуоресценции Комплементация: Высокая пропускная способность Количественный метод изучения взаимодействия белок-белок

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Выделение и функциональный анализ митохондрий из культивируемых клеток и мышь ткани

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Измеряя ферментативную активность лактазы в лаборатории обучения

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Обнаружение эстрогенных лигандов в продуктах личной внимательности с использованием дрожжей эстроген экран оптимизирован для лаборатории обучения студентов

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Лаборатория протокол для генетических кишки содержание анализа водных макробеспозвоночных использование конкретных групп рДНК грунтовки

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...