Name: functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00
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AOH y el MAS reconoce la Facultad de Ciencias y la Escuela H. Thomas Gosnell de Ciencias de la Vida en el Instituto de Tecnología de Rochester busca de apoyo. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencia de Estados Unidos (NSF) premio a AOH MCB-1120541.

NOTA: Los autores están dispuestos a proporcionar cepas bacterianas y plásmidos recombinantes para facilitar la incorporación del análisis de complementación funcional con fines didácticos para las personas que están interesadas. Los plásmidos que se utilizaron para facilitar los experimentos de complementación funcional se enumeran en la Tabla 1. 1. Construcción de los plásmidos de complementación funcional <ol><li> Clonación de diaminopimelato aminotransfera...

<ol>
	<li>Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Candida+albicans+gene+for+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+by+complementation+of+S.+cerevisiae+ura3+and+E.+coli+pyrF+mutations.">Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations.</a> Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).</li><li>Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+defines+a+novel+variant+of+the+lysine+biosynthesis+pathway+in+plants.">An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants.</a> Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).</li><li>Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate-derived+amino+acid+biosynthesis+in+Arabidopsis+thaliana.">Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana.</a> The Arabidopsis Book. , (2009).</li><li>Prabhu, P., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+partial+characterization+of+an+L-Tyrosine+aminotransferase+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana.</a> Biochemistry Research International. , 549572 (2010).</li><li>Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+pathogenic+bacteria+in+molecular+pathology.">Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).</li><li>McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate:+meso-2,6-diaminopimelate+ligase+(MurE)+from+Verrucomicrobium+spinosum+DSM+4136T.">Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).</li><li>Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lysine+biosynthesis:+an+evolving+antibiotic+strategy.">Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy.</a> Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical.">(p)ppGpp: still magical.</a> Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).</li><li>Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+response.">The stringent response.</a> Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Chatterji, D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+stringent+response,+ppGpp+and+starvation+signaling.">Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).</li><li>Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+stringent+response+and+survival.">ppGpp: stringent response and survival.</a> J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).</li><li>Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-UV+stress+in+Salmonella+typhimurium:+4-thiouridine+in+tRNA,+ppGpp,+and+pppGpp+as+components+of+an+adaptive+response.">Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response.</a> J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).</li><li>Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+alarms+and+cell+division+in+Escherichia+coli.">Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).</li><li>Mittenhuber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+evolution+of+genes+encoding+bacterial+(p)+ppGpp+synthetases/hydrolases+(the+Rel,+RelA,+and+SpoT+proteins).">Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins).</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).</li><li>Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+rsh+Gene+from+a+Novosphingobium+sp.+Necessary+for+Quorum-Sensing+Signal+Accumulation.">Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation.</a> J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).</li><li>Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+biochemical+analysis+of+the+diaminopimelate+and+lysine+biosynthesis+pathway+in+Verrucomicrobium+spinosum:+Identification+and+partial+characterization+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+and+UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate+ligase.">Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase.</a> Front. Microbiol. 3, 183 (2012).</li><li>Hudson, A. O., Gir&#242;n, I., Dobson, R. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+(DapL)+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).</li><li>Dobson, R. C. J., Gir &#242;n, I., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L,L-Diaminopimelate+Aminotransferase+from+Chlamydomonas+reinhardtii:+A+Target+for+Algaecide+Development.">L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development.</a> PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).</li><li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+regulation,+modulation,+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+pBAD+promoter.">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutants+of+Escherichia+coli+K-12+with+low+activity+of+the+diaminopimelic+acid+adding+enzyme.">Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme.</a> J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).</li><li>Mavrides, C., Orr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecific+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases+in+Escherichia+coli.">Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli.</a> J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).</li><li>Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+deficient+in+the+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases.">Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases.</a> J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).</li><li>Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispecific+quintet+of+aromatic+aminotransferases+that+overlap+different+biochemical+pathways+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).</li><li>Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+stringent+response+in+the+essential+function+if+the+conserved+bacterial+G+protein+CgtA+in+Vibrio+cholera.">Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).</li><li>Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+DNA+cloning+system+for+Gram-negative+bacteria:+construction+of+a+gene+bank+of+Rhizobium+meliloti.">Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).</li><li>Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+enzymatic+characterization+of+a+novel+&#946;-1,6-glucosidase+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and enzymatic characterization of a novel &#946;-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae.</a> J Biosci Bioeng. , (2015).</li><li>Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+ALD1+in+activation+of+local+and+systemic+defenses+in+Arabidopsis.">A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis.</a> Plant J. 40, 200-212 (2004).</li><li>Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+prediction+of+protein+function.">Automatic prediction of protein function.</a> Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).</li><li>Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+the+Arabidopsis+pds1+mutation+with+the+gene+encoding+p-Hyrdoxyphenylpyruvate+dioxygenase.">Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase.</a> Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).</li><li>Mohler, W. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+cell+fusion+analyzed+by+lacZ+complementation+in+mammalian+cells.">Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).</li></ol>

Muchos de los cursos que son parte integral del plan de estudios de Biotecnología y Biociencia Molecular en el Instituto de Tecnología de Rochester tienen un componente de laboratorio, además de la parte de lectura del curso. El plan de estudios para el año académico 2014-2015 contiene un total de 48 cursos, 29 de los cuales contienen un componente de laboratorio que representan aproximadamente el 60%. Uno de estos cursos es Fundamentos de Bioquímica Vegetal y Patología (FPBP), un curso mixto clase / laboratorio ...

complementación funcional en el contexto de elucidar la función (s) / papel (s) de un gen se define como la capacidad de un homólogo en particular o genes ortólogos para restaurar un mutante particular con un fenotipo observable al estado de tipo salvaje cuando la homóloga o genes ortólogos se introduce en cis o trans en el fondo mutante. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para aislar e identificar la función (s) / papel (s) de muchos genes. Un ejemplo particular es el aislamiento y la identificación de orotidina-5-fosfato a partir de Candida albicans usando el mutante ura3 de S. cerevisiae y el mutante pyrF de E. coli. 1 Los autores han utilizado esta técnica para elucidar la función de los genes que están involucrados en el metabolismo de aminoácidos, peptidoglicano y la respuesta estrictas en sus programas de investigación y han incorporado esta técnica en sus programas de enseñanza en el Ba biotecnología y Biociencia Molecular (BMB) programa en el Instituto de Tecnología de Rochester (RIT). Los autores enseñan Fundamentos de Bioquímica Vegetal / Patología (FPBP) (Hudson) y para Bios: Principios y Prácticas (BPP) (Hudson / Savka), dos cursos basados ​​en la división superior de laboratorio de elección en el Programa de BMB en el RIT. Dado que algunos de los temas que se tratan en los cursos están afiliados a sus intereses de investigación, los autores han incorporado muchas de las técnicas y herramientas experimentales que se utilizan en sus respectivos programas de investigación en estos dos cursos basados ​​en laboratorio. Un ejemplo es la complementación funcional como un ejercicio de laboratorio para reforzar los materiales de clase pertenecientes a metabolismo de aminoácidos de las plantas, peptidoglicano y el riguroso metabolismo respuesta de bacterias. Tres de las vías de aminoácidos de las plantas que se tratan en el curso FPBB son la de lisina (Lys), tirosina(Tyr) y fenilalanina (Phe). La vía de lys se pone de relieve en el curso debido a la importancia del aminoácido como un aminoácido esencial para todos los animales particularmente seres humanos ya que los animales carecen de la maquinaria genética para sintetizar lys de novo. Además, recientemente se ha descubierto que las plantas emplean una vía para la síntesis de lys que es significativamente diferente de la de bacterias. Este descubrimiento fue facilitada en parte por complementación funcional de la E. diaminopimelato coli (dap) mutantes utilizando un gen que codifica la enzima L, L-diaminopimelato aminotransferasa (DAPL) de la planta modelo Arabidopsis thaliana. 2 Las vías de variantes para la síntesis de lys a través de la diaminopimelato intermedios se muestran en la Figura 1. Además , la síntesis de lys facilita a través de la familia aspartato derivado de aminoácidos que está altamente regulado. 3 Además de su importancia en synt proteínasHESIS, las vías de Tyr y Phe se destacan por su importancia en servir como compuestos precursores para el anabolismo de compuestos fenilpropanoides involucrados la síntesis de compuestos de defensa de plantas tales como:. alcaloides, ligninas, flavonoides, isoflavonoides, ácido hidroxicinámico entre otros 4 El Tyr y las vías de phe también se destacan para mostrar la diferencia entre la central y las vías anabólicas bacterianas. En las bacterias, la tirosina aminotransferasa enzima (tyrB) está implicado en el anabolismo de ambos aminoácidos, mientras que en las plantas, la enzima es principalmente involucrada en el catabolismo de Tyr y Phe y no está implicado en el anabolismo de estos aminoácidos. (Figura 2). 4 Las diferencias entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas con respecto a la estructura de peptidoglicano (PG) se destacan en el curso FPBP. El PG de las bacterias Gram negativas es de interés en relación con la patología de plantas basado en el hecho de que la mayor partepatógenos de las plantas son Gram negativo. Una revisión reciente sobre los 10 fito-patógenos bacterianos reveló que todos son Gram negativas. Las bacterias eran de los géneros:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya y Pectobacterium 5 Una de las diferencias químicas cuando se compara el vástago de PG de bacterias positivos negativos y Gram es la diferencia entre la reticulación-amino ácidos de ambos tipos. El paso inicial para que diferentes reticulación de PG se produce en la etapa de citoplásmico de PG anabolismo y es facilitado por la enzima UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamato meso -2,6-ligasa diaminopimelato (mûre) (Figura 3A). Mûre cataliza la adición de un compuesto de diamina en particular en tercera posición del vástago de péptido. 6 En la mayoría de las bacterias Gram negativas, las lys penúltimo precursor, -diaminopimelate meso ( <em&gt; m -DAP) sirve como la reticulación de aminoácidos y lys sirve el mismo papel en la PG de la mayoría de las bacterias Gram positivas (Figura 3B). 7 Esto es debido al hecho de que tanto m -DAP y lys poseen dos amina grupos y son capaces de formar dos enlaces peptídicos de tallo péptido reticulación. En los Bioseparaciones: Principios y Prácticas de golf (BPP), se discuten las diferencias entre sistemas abiertos y cerrados para el cultivo de bacterias y cómo los niveles de nutrientes va a cambiar significativamente en ambos sistemas debido a los cambios ambientales. Estos eventos están vinculados a los cambios de la normativa solicitados un &quot;cambio hacia abajo&quot; o &quot;Desplazamiento hacia arriba&quot; provocados por el hambre o un suministro adecuado de aminoácidos o de energía. La respuesta de &quot;cambio-abajo&quot; puede ocurrir cuando un cultivo bacteriano se transfiere de un medio rico y complejo a un medio químicamente definido con una única fuente de carbono. Este cambio en el medio ambiente conduce a la rápida CESSAla de la síntesis de tRNA y rRNA. Este cese resultado en la falta de ribosomas, proteínas y la síntesis de ADN a pesar de que la biosíntesis de aminoácidos son upregulated. Tras la respuesta &quot;cambio-abajo&quot;, los ribosomas existentes se utilizan para producir nuevas enzimas para la síntesis de los aminoácidos ya no disponibles en el medio o entorno. Después de un período de tiempo, la síntesis de rRNA y nuevos ribosomas son ensamblados y la población de células bacterianas comienza a crecer, aunque a un ritmo reducido. El curso de los acontecimientos que se denomina la &quot;respuesta rigurosas&quot; o &quot;control estricto&quot; y es un ejemplo de la regulación celular global y se puede considerar como un mecanismo para ajustar la maquinaria biosintética de la célula para compensar la disponibilidad de los sustratos requeridos y las necesidades de energía . 8 la respuesta estrictas por lo tanto permite a las bacterias para responder con rapidez a los flujos de nutrientes en el medio ambiente y contribuye y ENHANCES la capacidad de las bacterias para competir en ambientes que pueden cambiar rápidamente con respecto a nutrientes y o la disponibilidad de sustrato. 8-9 La respuesta estrictas tiene un papel integral en la expresión de genes cuando la disponibilidad de aminoácidos, carbono, nitrógeno, fosfato y ácidos grasos son limitadas. 8,10-14 Esta respuesta estrictas está coordinado por dos nucleótidos, tetrafosfato de guanosina (ppGpp) y guanosina pentafosfato (pppGpp) conoce comúnmente como el conjunto alarmone (p) ppGpp. Por ejemplo, cuando los aminoácidos están limitadas-que puede conducir a un cuello de botella en la síntesis de proteínas-la alarmone, guanosina 3,5- (bis) pirofosfato (ppGpp), derivado de anabolismo de guanosina 3-difosfato 5-trifosfato (pppGpp) acumula en la célula. El cambio de nivel (p) ppGpp está implicado en la expresión de los genes que regulan la respuesta para superar la falta de sustratos en el entorno que están directamente involucrados en el crecimiento celular y development. Dos de los genes que están involucrados en este proceso son los llamados relA y Spot. De RelA es un (p) ppGpp sintetasa ribosoma-asociado que está implicado en la respuesta a la acumulación de tRNA no cargados que es el resultado de la limitación de aminoácidos. funciones de detectar como un bifuncional (p) ppGpp sintetasa y hidrolasa. La actividad de la sintetasa de la mancha está implicado en la respuesta a la falta de privación de carbono y el ácido graso. 8 Los homólogos de RelA / SPOT se han generalizado en plantas y bacterias, y se conocen como Rsh para R ELA / S POT h omologs 8,10. -12,16 un manuscrito reciente mostró que hay una proteína Rsh específica implicada en la síntesis de estos alarmones de la bacteria Novosphingobium sp Rr 2-17. 17 Aquí presentamos cuatro vías bioquímicas atados a los ensayos de complementación funcional. Los ensayos de complementación descritos en este manuscrito ofrece una vía para explmineral de empleo de este ensayo in vivo como medio de identificación y caracterización de enzimas o que se predice que tienen función desconocida / putativo (s) o como herramientas de enseñanza para complementar la enseñanza de las rutas bioquímicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">E. coli mutants</td>
			<td style="width:372px;">Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652082</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature controlled incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Agar</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>22700025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12795084</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M9 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63011</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Medium</td>
			<td>Fisher Scientfic&#160;</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diaminopimelate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92591</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0376</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenlylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gylcerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracyline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10342-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11708-013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15224-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Dh5-alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td align="right">18258012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Top10</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>C4040-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET100D/topo vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCR2.1 Vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K2030-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways

Ensayo de complementación funcional (FCA) es un ensayo in vivo que se utiliza ampliamente para dilucidar la función / papel de los genes / enzimas. Esta técnica es muy común en la bioquímica, la genética y muchas otras disciplinas. Una visión global de la técnica para complementar la enseñanza de las vías bioquímicas que pertenecen a los aminoácidos, peptidoglicano y la respuesta estrictas bacteriana se informa en este manuscrito. Dos ADNc de la planta modelo thaliana organismo Arabidopsis que están involucrados en el metabolismo de la lisina (L, aminotransferasa-L diaminopimelato (DAPL) y tirosina aminotransferasa (tyrB) que participan en el metabolismo de la tirosina y fenilalanina están resaltados. Además, el peptidoglicano bacteriano vía anabólica se pone de relieve por medio del análisis del gen de UDP-N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamato meso -2,6-ligasa diaminopimelato (mûre) de la bacteria Verrucomicrobium spinosum involucrado en la cruz-linking de peptidoglicano. La respuesta estrictas bacteriana También se informa a través del análisis de la rsh (r ela / s Pot h omolog) gen bifuncional responsables de un fenotipo hiper-mucoide en la bacteria Novosphingobium sp., Se presentan cuatro ejemplos de FCA. El vídeo se centrará en tres de ellos, a saber, la lisina, peptidoglicano y la respuesta estrictas.

Las cepas bacterianas que se emplean en los diversos análisis de complementación funcional se enumeran en la Tabla 2. análisis de complementación funcional: L, L-aminotransferasa diaminopimelate (DAPL) El E. coli mutante doble AOH1 (Δ dapD :: Kan2, dapE6) alberga una mutación en el gen dapE y una deleción completa d...

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Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

La validación de las actividades enzimáticas implicadas en las vías bioquímicas se puede elucidar el uso de análisis de complementación funcional (FCA). Se describe en este manuscrito es el ensayo FCA que demuestra la actividad enzimática de las enzimas implicadas en el metabolismo de aminoácidos, estrictas respuesta bacteriana y la biosíntesis de peptidoglicano bacteriano.

Análisis de Complementación funcional (FCA): Un ejercicio de laboratorio diseñado e implementado para Complementar la enseñanza de la bioquímica Pathways

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Trasplante de lentes en el pez cebra y su aplicación en el análisis de mutantes de ojos

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Fluorescencia de Complementación bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

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Determinación de la Contribución de los Sistemas de energía durante el ejercicio

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

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Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

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