Name: functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

AOH och MAS erkänner College of Science och Thomas H. Gosnell School of Life Sciences vid Rochester Institute of Technology för stöd. Detta arbete stöddes delvis av USA National Science Foundation (NSF) utmärkelse till AOH MCB-1.120.541.

OBS: Författarna är villiga att ge bakteriestammar och rekombinanta plasmider för att underlätta införandet av funktionell komplettering analys för undervisningsändamål för personer som är intresserade. Plasmiderna som användes för att underlätta funktionell komplettering experiment är angivna i tabell 1. 1. Konstruktion av plasmider för funktionell komplettering <ol><li> Kloning av diaminopimelat-aminotransferas (dapL) för funktionell komplettering. <ol><l...

<ol>
	<li>Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+Candida+albicans+gene+for+orotidine-5'-phosphate+decarboxylase+by+complementation+of+S.+cerevisiae+ura3+and+E.+coli+pyrF+mutations.">Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations.</a> Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).</li><li>Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+defines+a+novel+variant+of+the+lysine+biosynthesis+pathway+in+plants.">An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants.</a> Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).</li><li>Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate-derived+amino+acid+biosynthesis+in+Arabidopsis+thaliana.">Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana.</a> The Arabidopsis Book. , (2009).</li><li>Prabhu, P., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+partial+characterization+of+an+L-Tyrosine+aminotransferase+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana.</a> Biochemistry Research International. , 549572 (2010).</li><li>Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+pathogenic+bacteria+in+molecular+pathology.">Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).</li><li>McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate:+meso-2,6-diaminopimelate+ligase+(MurE)+from+Verrucomicrobium+spinosum+DSM+4136T.">Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).</li><li>Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+lysine+biosynthesis:+an+evolving+antibiotic+strategy.">Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy.</a> Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).</li><li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(p)ppGpp:+still+magical.">(p)ppGpp: still magical.</a> Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).</li><li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence.">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).</li><li>Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stringent+response.">The stringent response.</a> Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Chatterji, D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+stringent+response,+ppGpp+and+starvation+signaling.">Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).</li><li>Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+stringent+response+and+survival.">ppGpp: stringent response and survival.</a> J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).</li><li>Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-UV+stress+in+Salmonella+typhimurium:+4-thiouridine+in+tRNA,+ppGpp,+and+pppGpp+as+components+of+an+adaptive+response.">Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response.</a> J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).</li><li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+horizons+for+(p)ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology.">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).</li><li>Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+alarms+and+cell+division+in+Escherichia+coli.">Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).</li><li>Mittenhuber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+evolution+of+genes+encoding+bacterial+(p)+ppGpp+synthetases/hydrolases+(the+Rel,+RelA,+and+SpoT+proteins).">Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins).</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).</li><li>Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+rsh+Gene+from+a+Novosphingobium+sp.+Necessary+for+Quorum-Sensing+Signal+Accumulation.">Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation.</a> J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).</li><li>Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+biochemical+analysis+of+the+diaminopimelate+and+lysine+biosynthesis+pathway+in+Verrucomicrobium+spinosum:+Identification+and+partial+characterization+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+and+UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate+ligase.">Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase.</a> Front. Microbiol. 3, 183 (2012).</li><li>Hudson, A. O., Gir&#242;n, I., Dobson, R. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+L,L-diaminopimelate+aminotransferase+(DapL)+from+Chlamydomonas+reinhardtii.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).</li><li>Dobson, R. C. J., Gir &#242;n, I., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L,L-Diaminopimelate+Aminotransferase+from+Chlamydomonas+reinhardtii:+A+Target+for+Algaecide+Development.">L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development.</a> PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).</li><li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+regulation,+modulation,+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+pBAD+promoter.">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutants+of+Escherichia+coli+K-12+with+low+activity+of+the+diaminopimelic+acid+adding+enzyme.">Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme.</a> J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).</li><li>Mavrides, C., Orr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecific+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases+in+Escherichia+coli.">Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli.</a> J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).</li><li>Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+deficient+in+the+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases.">Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases.</a> J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).</li><li>Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispecific+quintet+of+aromatic+aminotransferases+that+overlap+different+biochemical+pathways+in+Pseudomonas+aeruginosa.">A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).</li><li>Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+stringent+response+in+the+essential+function+if+the+conserved+bacterial+G+protein+CgtA+in+Vibrio+cholera.">Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).</li><li>Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+DNA+cloning+system+for+Gram-negative+bacteria:+construction+of+a+gene+bank+of+Rhizobium+meliloti.">Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).</li><li>Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+enzymatic+characterization+of+a+novel+&#946;-1,6-glucosidase+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and enzymatic characterization of a novel &#946;-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae.</a> J Biosci Bioeng. , (2015).</li><li>Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+ALD1+in+activation+of+local+and+systemic+defenses+in+Arabidopsis.">A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis.</a> Plant J. 40, 200-212 (2004).</li><li>Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+prediction+of+protein+function.">Automatic prediction of protein function.</a> Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).</li><li>Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+the+Arabidopsis+pds1+mutation+with+the+gene+encoding+p-Hyrdoxyphenylpyruvate+dioxygenase.">Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase.</a> Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).</li><li>Mohler, W. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+cell+fusion+analyzed+by+lacZ+complementation+in+mammalian+cells.">Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).</li></ol>

Många av de kurser som är en integrerad del av bioteknik och molekylär biovetenskap läroplan vid Rochester Institute of Technology har en laboratoriekomponent utöver föreläsningen del av kursen. Läroplanen för läsåret 2014-2015 innehåller totalt 48 kurser, 29 som innehåller ett laboratorium komponent som utgör cirka 60%. En sådan kurs är Fundamentals of växtbiokemi och patologi (FPBP), en blandad föreläsning / laborationer och bioseparationer: Principer och metoder (BPP), ett laboratoriebaserat kurs. ...

Funktionell komplettering i samband med kunskaper om funktionen (er) / roll (er) av en gen definieras som förmågan hos en viss homolog eller ortolog gen för att återställa en viss mutant med en observerbar fenotyp till vildtyp tillstånd när den homologa eller ortologa gen införs i cis eller träns i den muterade bakgrunden. Denna teknik har använts i stor utsträckning för att isolera och identifiera den funktion (er) / roll (er) av många gener. Ett särskilt exempel är isolering och identifiering av orotidin-5-fosfatdekarboxylas från Candida albicans med användning av ura3-mutant av S. cerevisiae och pyrF mutant av E. coli. 1 Författarna har använt denna teknik för att belysa funktionen av gener som är involverade i metabolismen av aminosyror, peptidoglykan och stränga svar i sina forskningsprogram och har införlivat denna teknik i sina undervisningsprogram i Biotechnology och molekylär biovetenskap (BMB) programmet vid Rochester Institute of Technology (RIT). Författarna lär Fundamentals of växtbiokemi / patologi (FPBP) (Hudson) och bioseparationer: Principer och metoder (BPP) (Hudson / Savka), två övre division elektiv laboratorium baserade kurser i BMB Program vid KTH. Eftersom några av de ämnen som diskuteras i kurserna är anslutna med sina forskningsintressen har författarna införlivat många av de tekniker och experimentella verktyg som används i deras respektive forskningsprogram i dessa två laboratoriebaserade kurser. Ett sådant exempel är funktionell komplettering som en laboration att förstärka föreläsningsmaterial avseende aminosyrametabolismen från växter, peptidoglykan och stränga svar ämnesomsättning från bakterier. Tre av aminosyravägar från växter som diskuteras i FPBB kursen är att lysin (Lys), tyrosin(Tyr) och fenylalanin (phe). Lys vägen markeras under på grund av vikten av aminosyran som en essentiell aminosyra för alla djur i synnerhet människor eftersom djur saknar den genetiska maskineri för att syntetisera lys de novo. Dessutom upptäcktes nyligen det att växter använder en väg för syntes av lys som är väsentligt skild från den hos bakterier. Denna upptäckt delvis underlättas genom funktionell komplettering av E. coli diaminopimelat (DAP) mutanter med användning av en gen som kodar för enzymet L, L-diaminopimelat aminotransferas (DapL) från modellväxten Arabidopsis thaliana. 2 Varianten vägar för syntes av lys genom den mellanliggande diaminopimelat visas i figur 1. Dessutom underlättar syntesen av lys genom aspartat härledda familj av aminosyror som är strängt reglerad. 3 Utöver deras betydelse i protein synthesis, banorna för tyr och phe är markerade med tanke på deras betydelse i tjänstgör som prekursorföreningar för anabolism av fenylpropanoider föreningar involverade syntesen av växtförsvars föreningar såsom:. alkaloider, ligniner, flavonoider, isoflavonoider, hydroxikanelsyra bl a 4 tyr och Phe vägar är också markeras för att visa skillnaden mellan växt- och bakterie anabola vägar. I bakterier, är enzymet tyrosinaminotransferas (TyrB) involverade i anabolism av både aminosyror, medan i växter, är i första hand involverade i katabolismen av tyr och phe enzymet och inte är involverad i anabolism av dessa aminosyror. (Figur 2). 4 Skillnaderna mellan grampositiva och gramnegativa bakterier om strukturen av peptidoglykan (PG) är markerade i FPBP kursen. PG av gramnegativa bakterier är av intresse när det gäller växtpatologi baserat på det faktum att de flestaväxtpatogener är gramnegativa. En nyligen genomförd granskning beträffande de 10 bakteriella fyto-patogener visade att alla är gramnegativa. Bakterierna var från släktena:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya och Pectobacterium 5 En av de kemiska skillnaderna när man jämför PG stammen av gramnegativa och grampositiva bakterier är skillnaden mellan tvärbindnings amino syror av båda typerna. Det första steget för att olika tvärbindning av PG förekommer i den cytoplasmiska steget av PG anabolism och underlättas av enzymet UDP N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso -2,6-diaminopimelat ligas (MURE) (figur 3A). MURE katalyserar additionen av en speciell diaminförening vid tredje positionen av peptiden stammen. 6 I de flesta gramnegativa bakterier, de näst sista lys prekursor, meso -diaminopimelate ( <em&gt; m -DAP) tjänar som tvärbindnings aminosyran och lys tjänar samma roll i PG för de flesta grampositiva bakterier (Figur 3B). 7 Detta beror på det faktum att både m -DAP och lys besitter två amin grupper och har förmåga att bilda två peptidbindningar för peptid stam tvärbindning. I bioseparationer: Principles and Practices (BPP) Naturligtvis är skillnaderna mellan öppna och slutna system för odling av bakterier och hur näringsnivåer kommer att förändras avsevärt i båda systemen på grund av miljöförändringar diskuteras. Dessa händelser är kopplade till regeländringar som kallas en &quot;nedväxling&quot; eller &quot;växla upp&quot; utlöses av svält eller ett tillräckligt utbud av aminosyror eller energi. Den &quot;skifta ned&quot; svar kan uppstå när en bakteriekultur överförs från en rik och komplex medium till ett kemiskt definierat medium med en enda kolkälla. Denna förändring i miljön leder till den snabba cessaning av tRNA och rRNA syntes. Denna avbrutna resulterar i avsaknaden av ribosomer, protein och DNA-syntes, även om biosyntesen av aminosyror är uppreglerade. Efter &quot;nedväxling&quot; svar, de befintliga ribosomer för att ta fram nya enzymer för att syntetisera aminosyrorna inte längre finns i mediet eller miljön. Efter en tid, är rRNA syntes och nya ribosomer monteras och populationen av bakterieceller börjar växa om än i reducerad hastighet. Händelseförloppet kallas &quot;stringenta svaret&quot; eller &quot;sträng kontroll&quot; och är ett exempel på global cellulär reglering och kan ses som en mekanism för att justera cellens biosyntetiska maskineri för att kompensera för tillgängligheten av de nödvändiga substrat och energibehov . 8 stränga svar möjliggör sålunda bakterier att snabbt reagera på flöden av näringsämnen i miljön och bidrar och enhrätterna bakteriers förmåga att konkurrera i miljöer som kan ändras snabbt när det gäller näringsämnen och eller substrat tillgänglighet. 8-9 Den stränga svar har en viktig roll i genuttryck när tillgången av aminosyror, kol, kväve, fosfat och fettsyror är begränsade. 8,10-14 Denna stränga svar samordnas av två nukleotider, guanosin tetra (ppGpp) och guanosin pentafosfat (pppGpp) som vanligtvis tillsammans som alarmone (p) ppGpp. Till exempel, när aminosyror är begränsade-som kan leda till en flaskhals i proteinsyntes-the alarmone, guanosin 3,5- (bis) pyrofosfat (ppGpp), härledd från anabolism av guanosin 3-difosfat 5-trifosfat (pppGpp) ackumulerar i cellen. Förändringen i (p) ppGpp nivå är involverade i expression av gener som styr svaret för att övervinna bristen på substraten i miljön som är direkt involverade i celltillväxt och development. Två av de gener som är involverade i denna process kallas Rela och Spot. RelA är ett ribosom-associerade (p) ppGpp syntetas som är involverad i responsen till en ackumulering av oladdade tRNA-sekvenser som är resultatet av aminosyra begränsning. Spot fungerar som en bifunktionen (p) ppGpp syntetas och hydrolas. Den syntetasaktivitet av fläck är involverad i reaktion på avsaknaden av kol och fettsyra svält. 8 De RelA / Spot-homologer är utbrett i växter och bakterier och kallas Rsh för R Ela / S POT h omologs. 8,10 -12,16 en nyligen manuskript visade att det finns en specifik Rsh protein involverat i syntesen av dessa alarmones från bakterien Novosphingobium sp Rr 2-17. 17 Här presenterar vi fyra biokemiska vägar bundna till funktionell komplettering analyser. Komplemente analyser som beskrivs i detta manuskript ger en väg att EXPLmalm med användning av denna analys in vivo som ett medel för att identifiera och eller karakterisera enzymer som förutsägs ha okänd / förmodade funktion (er) eller som pedagogiska verktyg för att komplettera undervisningen av biokemiska vägar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">E. coli mutants</td>
			<td style="width:372px;">Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Biorad-USA</td>
			<td>1652082</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature controlled incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Agar</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>22700025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12795084</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M9 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63011</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Medium</td>
			<td>Fisher Scientfic&#160;</td>
			<td>DF0013-15-8</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diaminopimelate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92591</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thymine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0376</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phenlylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gylcerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracyline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>87128</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10342-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11708-013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15224-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Dh5-alpha</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td align="right">18258012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E coli Top10</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>C4040-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET100D/topo vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCR2.1 Vector</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>K2030-01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional complementation analysis (fca): a laboratory exercise designed and implemented to supplement the teaching of biochemical pathways

Funktionell komplettering analys (FCA) är en in vivo-analys som ofta används för att belysa funktionen / roll gener / enzymer. Denna teknik är mycket vanligt i biokemi, genetik och många andra discipliner. En omfattande översikt av tekniken för att komplettera undervisningen av biokemiska vägar som hänför sig till aminosyror, peptidoglykan och den bakteriella stränga svar redovisas i detta manuskript. Två cDNA från modellväxten organism Arabidopsis thaliana som är involverade i metabolismen av lysin (L, L-diaminopimelat aminotransferas (dapL) och tyrosin-aminotransferas (tyrB) som är involverade i metabolismen av tyrosin och fenylalanin är markerade. Dessutom den bakteriella peptidoglykan anabola pathway markeras genom analys av UDP N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso -2,6-diaminopimelat ligas (MURE) genen från bakterien Verrucomicrobium spinosum involverad i tvär-linking av peptidoglykan. Den bakteriella stringent svar rapporteras också genom analys av den rsh (r ELA / s POT h omolog) bifunktionella gen som är ansvarig för en hyper-mukoid fenotyp i bakterien Novosphingobium sp. Fyra exempel på FCA presenteras. Videon kommer att fokusera på tre av dem, nämligen lysin, peptidoglykan och stringenta svaret.

De bakteriestammar som används i de olika funktionella komplemente analyser är angivna i tabell 2. Funktionell komplettering Analys: L, L-diaminopimelat aminotransferas (dapL) E. coli dubbel mutant AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) hyser en mutation i dapE genen och en fullständig deletion av DAPD genen (Figur 1).</...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways at JoVE.com

Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Valideringen av enzymatiska aktiviteter som ingår i biokemiska vägar kan belysas med hjälp av funktionell komplettering analys (FCA). Beskrivs i detta manuskript är Konkurrensverket analysen visar den enzymatiska aktiviteten av enzymer som är involverade i metabolismen av aminosyror, bakteriell stränga svar och bakteriell peptidoglykan biosyntesen.

Funktionell komplettering Analysis (FCA): A Laboratory Exercise utformas och genomförs för att komplettera undervisningen i biokemiska vägar

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Lens Transplantation i Zebrafish och dess tillämpning i analysen av Eye Mutanter

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenes och funktionsanalys av jonkanaler Uttryckt Heterologously i däggdjursceller

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Bimolecular Fluorescens komplement

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

Fastställande av bidrag Energy Systems under träning

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartläggning Bakteriella funktionella nätverk och vägar i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Använda syntetiska genetiska Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flödescytometrianalyser av Bimolecular Fluorescens Komplettering: En hög genomströmning kvantitativ metod för att studera protein-protein interaktion

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering och Funktionell analys av mitokondrier från odlade celler och mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Mäta laktas enzymatisk aktivitet i undervisningen labbet

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Att upptäcka östrogena ligander i personliga hygienprodukter använder en jäst östrogen skärmen optimerad för grundutbildning undervisning laboratoriet

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Laboratoriet protokoll för genetiska Gut innehåll analyser av vattenlevande Macroinvertebrates använda gruppspecifika rDNA grundfärger

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...