Name: combined optogenetic and freeze-fracture replica immunolabeling to examine input-specific arrangement of glutamate receptors in the mouse amygdala
Uploaded: 2016-04-15T15:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala at JoVE.com

Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.

<ol>
	<li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-digested+freeze-fracture+replica+labeling+electron+microscopy+to+study+the+two-dimensional+distribution+of+integral+membrane+proteins+and+phospholipids+in+biomembranes:+practical+procedure,+interpretation+and+application.">SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application.</a> Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).</li><li>Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantitative+visualization+of+glutamate+and+GABA+receptors+at+central+synapses.">High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).</li><li>Rash, J. E., Yasumura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+immunogold+labeling+of+connexins+and+aquaporin-4+in+freeze-fracture+replicas+of+liver,+brain,+and+spinal+cord:+factors+limiting+quantitative+analysis.">Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis.</a> Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).</li><li>Emes, R. D., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+synapse+complexity+and+diversity.">Evolution of synapse complexity and diversity.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).</li><li>Matsuzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+geometry+is+critical+for+AMPA+receptor+expression+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).</li><li>Rollenhagen, A., L&#252;bke, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+of+excitatory+central+synapses:+from+structure+to+function.">The morphology of excitatory central synapses: from structure to function.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).</li><li>Tarusawa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-specific+intrasynaptic+arrangements+of+ionotropic+glutamate+receptors+and+their+impact+on+postsynaptic+responses.">Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses.</a> J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).</li><li>Nusser, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus.">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).</li><li>Ny&#236;ri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+variability+in+synaptic+N-methyl-D-aspartate+receptor+density+on+interneurons+and+a+comparison+with+pyramidal-cell+spines+in+the+rat+hippocampus.">Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).</li><li>Nicholson, D. A., Geinisman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axospinous+synaptic+subtype-specific+differences+in+structure,+size,+ionotropic+receptor+expression,+and+connectivity+in+apical+dendritic+regions+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).</li><li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+cells+of+the+amygdala.">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li><li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala.">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li><li>Amano, T., Unal, C. T., Par&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+correlates+of+fear+extinction+in+the+amygdala.">Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala.</a> Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).</li><li>Duvarci, S., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+microcircuits+controlling+learned+fear.">Amygdala microcircuits controlling learned fear.</a> Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).</li><li>J&#252;ngling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+S-mediated+control+of+fear+expression+and+extinction:+role+of+intercalated+GABAergic+neurons+in+the+amygdala.">Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala.</a> Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).</li><li>Asede, D., Bosch, D., L&#252;thi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala.">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li><li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+Pavlovian+fear+conditioning.">Neurobiology of Pavlovian fear conditioning.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).</li><li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition,+expression,+and+extinction+of+conditioned+fear.">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li><li>Sigurdsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+the+amygdala:+a+cellular+mechanism+of+fear+learning+and+memory.">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li><li>Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+optogenetic+dissection+of+fear+circuits+in+brain+slices.">Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53628 (2016).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li><li>Bienvenu, T. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+intercalated+neurons+of+amygdala+relay+noxious+sensory+information.">Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information.</a> J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).</li><li>Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+aggregations+at+specialized+sites+in+freeze-etched+postsynaptic+membranes.">Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes.</a> Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).</li><li>Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Par&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+intercalated+neurons+are+required+for+expression+of+fear+extinction.">Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction.</a> Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).</li><li>Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-synapse-type+and+inter-synapse-type+relationships+between+synaptic+size+and+AMPAR+expression.">Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).</li><li>Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+cytochemistry+in+neuroscience.">Immunogold cytochemistry in neuroscience.</a> Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).</li><li>Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R., Cavalier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-digested+Freeze-fracture+replica+labelling+(SDS-FRL).">SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL).</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 567-586 (2007).</li><li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+electron+microscopy.">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).</li><li>Tanaka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+density+of+AMPA+receptors+in+single+synapses+in+immature+cerebellum.">Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum.</a> J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).</li><li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subsynaptic+localization+of+type+1+metabotropic+glutamate+receptors+at+glutamatergic+and+GABAergic+synapses+in+the+rodent+cerebellar+cortex.">Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex.</a> Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Fryse-fraktur elektronmikroskopi har været et stort teknik i ultrastrukturel forskning i over 40 år. Men manglen på effektive midler til at studere den molekylære sammensætning af membraner produceret et markant fald i brugen. For nylig har der været en stor vækkelse i fryse-fraktur-elektronmikroskopi som følge af udviklingen af effektive måder at afsløre integrale membranproteiner ved immunguld mærkning 1, 2, nemlig FRIL teknik. Den FRIL teknik har adskillige fordele frem for andre immunogold ultrastrukturelle metoder. Første, proteiner er let tilgængelige for antistoffer forøgelse af følsomheden. Sekund, eksponering af stor del af plasmamembran specialiseringer, såsom den postsynaptiske membran på den todimensionale overflade af replika tillader inspektion af den rumlige fordeling og fysisk grænseforholdet af molekyler af interesse uden besværlig og tidskrævende genopbygning af alvoral ultratynde sektioner. Tredje, tilgængeligheden af ​​begge halvdele af plasmamembranen øger antallet af proteiner, der kan mærkes for hver enkelt struktur, forudsat egnede antistoffer er tilgængelige. Ved frakturering, er den hydrofobe forside af den opdelte membran belagt med carbon-platin, der befæster proteindomæner forbliver på brudfladen. Dette forhindrer adgang af antistoffer til antigener på disse områder. For eksempel på P-flade af en replika kan detekteres kun epitoper overfor protoplasmisk rum med antistoffer, hvorimod på E-ansigt kun epitoper overfor exoplasmic rum kan bindes af antistoffer (se figur 2). På den anden side, den FRIL teknik lider også af visse begrænsninger 2. Som frakturer opstår tilfældigt, kan det være svært at målrette specifikke celler eller strukturer. Dette kan også føre til en sampling bias, fx i synapse indsamling betragtning af den forskellige sandsynlighed for FRActuring langs membranen af strukturer med forskellig krumning (f.eks, pigge versus aksler). Endvidere tildeling af membranproteiner til en af ​​de to flader er uforudsigelig. Derfor fordelingen af ​​et protein til P-ansigt eller E-ansigt, især for kvantitative undersøgelser, bør undersøges nøje ved anvendelse af antistoffer reaktive mod intracellulære og ekstracellulære domæner. Endelig identifikation i replika af visse strukturer, såsom præsynaptiske Axon terminaler, kan være svært, når kun baseret på morfologiske træk. Men anvendelsen af ​​specifikke antistoffer for markørproteiner eller transduktionen af ​​taggede integrale membranproteiner eller kanaler ved hjælp virale vektorer tilbyder yderligere værktøjer lettere at identificere de frakturerede membraner. For eksempel denne undersøgelse benyttede transduktion af CHR2-YFP i thalamiske neuroner til at identificere deres axonale efferents i amygdala eller mærkning af μ-opioidreceptorer at afsløre postsynaptiske migmbranes af ITC neuroner. For at kunne udføre den FRIL teknik med succes, skal der tages særlig omhu vedrørende vævsfiksering. Stærk vævsfiksering (&gt; 2% paraformaldehyd) kan resultere i en høj grad af tværgående frakturer og et fald i følsomhed mærkning. På den anden side, svage fikseringer gøre vævet håndtering og tilberedning (fx skæring af sektioner) vanskelig. Det er også vigtigt at kontrollere, at tykkelsen af ​​de trimmede klodser passer tykkelsen af ​​det dobbeltsidede tape. Hvis tykkelsen af ​​prøven er lavere end den af ​​båndet, kan overfladerne af væv ikke vedhæfte til overfladen af ​​de to metal bærere er dermed de frosne prøve ikke brækket. Hvis vævet er tykkere, vil det blive komprimeret med uundgåelige strukturelle forvridninger, når sandwichen af ​​de to kobber bærere er lavet. Den temperatur, ved hvilken prøven er brækket (i denne protokol, -115 ° C) spiller også en vigtig rollepå strukturen af ​​replika. Højere temperaturer kan frembringe en højere artefakter, såsom kondensering af vanddamp på overfladen af ​​vævet før eller under fordampning. Lavere temperaturer (&lt;-125 ° C) kan øge risikoen for fraspaltning af materiale under frakturering. Dette materiale kan falde på overfladen af ​​prøven eller holde forbindelsen til det. Disse flager af materiale er også belagt og kontrast producerer mørke pletter på billedet. Briste ved lavere temperaturer kan også påvirke hyppigheden af ​​cross-frakturer især for små fine strukturer såsom dendritiske pigge. En yderligere afgørende skridt i forberedelsen af ​​replikaer er vaskemiddel-fordøjelse. Hvis fordøjelsen er ufuldstændig, vises ufordøjet væv som mørke pletter på replika, confounding analysen af ​​strukturen på TEM. Desuden ufordøjet væv kan uspecifikt fælde eller binder antistoffer, hvilket øger mærkningen baggrunden. På den anden side er anvendelsen af ​​detergents for vævsfordøjelse kan denaturere molekylerne forbundet til replika ændre deres sekundære og tertiære strukturer. Derfor, for visse antigener kan det være nødvendigt gradvist at fortynde koncentrationen af ​​SDS med yderligere vasketrin. For immunolabeling, tilgængeligheden af ​​forskellige størrelser af guldpartikler konjugeret til sekundære antistoffer gør det muligt at detektere på samme tid, men kun kvalitativt multiple proteiner, selv i særlige mikrodomæner af plasmamembranen, såsom den postsynaptiske specialisering. Men på grund af sterisk hindring, kvantitative undersøgelser er generelt begrænset til påvisning af blot ét molekyle. Størrelsen af ​​guldpartikler og kan også påvirke effekten mærkning. Ved fortolkningen af ​​mærkningen i FRIL, skal det holdes for øje, at immunoguld partiklen kan placeres hvor som helst inden for en halvkugle med en radius på 20-25 nm fra antigenet på grund af den fleksible komplekse formulared af den primære og sekundære antistof 26. For yderligere information om teori og praksis af FRIL og relaterede teknikker, henviser vi læseren også til andre metodologiske artikler 27, 28. Den FRIL Teknikken er for nylig blevet anvendt til høj opløsning kvantitative analyser af glutamat receptor lokalisering i diverse synapse populationer 29, 30. Desuden påvisning følsomheden af FRIL teknik til AMPA-R&#39;er blev anslået så højt som en immunguld partikel pr en funktionel AMPA -R kanal 29. Således er denne tilgang er generelt meget nyttigt at kvantificere og analysere mønstret af postsynaptiske udtryk for AMPA-R og NMDA-R&#39;er på centrale synapser. Her demonstrerede vi dens anvendelighed på PIN / MGN-ITC synapser, et websted sandsynligvis vigtigt for genudlægning amerikanske oplysninger under frygt condition. Anvendelse af et antistof dannet mod de stærkt konserverede ekstracellulære aminosyrerester af AMPA receptor-underenheder GluA1-GluA4, fandt vi en jævn fordeling af guldpartikler inden IMP klynger svarende til postsynaptiske membran specialiseringer. Tætheden af ​​AMPA-R&#39;er i ITC pigge var signifikant højere i forhold til aksel synapser målrettet med PIN / MGN thalamiske afferenter. På begge rygsøjlen og akslen synapser, blev en positiv korrelation mellem mærkning af AMPA-R&#39;er og postsynaptiske område opdaget, en funktion fælles for andre glutamaterge synapser 25. Den lave varians i tætheden af AMPA-R&#39;er i PIN / MGN-ITC synapser indikerer en homogen fordeling ligner andre synapser dannet af thalamiske efferents 7, men forskellig fra kortikale synapser 25. Omvendt tætheden af ​​NMDA-R&#39;er var mere variabel og var ikke forskellig mellem rygsøjlen og akslen synapser tyder en anden regulering end AMPA-R&#39;er. I fremtiden vil den høje reproducerbarhed FRIL teknik ikke kun tillader at vurdere basale molekylære sammensætning af centrale synapser, men kan lette afsløringen af ​​cNDRINGER i ionotrope glutamat receptor numre og subsynaptic fordeling efter frygt læring, der supplerer ex-vivo optagelser af præ- og postsynaptiske egenskaber af disse indgange. Afslutningsvis kan denne fremgangsmåde bruges af andre forskere at få indblik i mellem struktur og funktion af input-specifikke excitatoriske synapser i mange andre neurale kredsløb, hvor udrede oprindelsen af ​​indgangene og arten og sammensætningen af ​​postsynaptiske elementer er afgørende, men problematisk .

Definitionen af ​​den funktionelle arkitektur biomembraner på nanometer skala er blevet udfordret i de seneste år med udviklingen af ​​en række immunolabeling teknikker egnet til transmission elektronmikroskopi. Men disse teknikker, fx før og efter embedding immunogold, har en række vigtige begrænsninger, der indbefatter dårlig detektion af antigener og / eller begrænset kvantitativ vurdering af membranbundne proteiner. Disse begrænsninger bliver særlig kritisk i forbindelse med undersøgelsen af ​​den fine struktur af nervesystemet, som er kendetegnet ved en høj grad af celle mangfoldighed og synapse heterogenitet. Denne uensartethed skyldes både strukturel og funktionel diversitet dikteret af præ- og postsynaptiske elementer og ved den differentielle ekspression, berigelse eller interaktion af signalproteiner, såsom receptorer, transportører og effektormolekyler. En ny tilgang til direkte immunolabeLing af integrerede eller tværbunden membranproteiner i vaskemiddel-opløst fryse-fraktur replikaer (FRIL) blev oprindeligt introduceret af Fujimoto to årtier siden en. Denne oprindelige metode havde imidlertid flere begrænsninger, dvs. alvorlig fragmentering af replikaer, som har begrænset meningsfulde korrelationer af mærkede molekyler med individuelt kortlagte celler i komplekse væv, såsom hjernen. Ca. 10 år siden, Shigemoto og Fukazawa gradvist forbedret teknik 2. Dette blev modsvaret af indsatsen fra en anden gruppe af forskere ved de Boulder laboratorier Colorado State University, der også væsentligt forbedret den teknik, især for studiet af gap junctions 3. Forbedringen i fryse-frakturering protokoller og maskiner, samt indførelsen af ​​hurtig nedfrysning (under højt tryk), nu giver efterforskerne til at producere ubrudt kopier af eksemplarer af relativt store størrelse og high kvalitet billeder af de fleste cellulære komponenter uden de begrænsninger og artefakter produceret af stærke kemiske optagelser. Den FRIL teknik giver den store fordel af en yderst kvantitativ in situ identifikation af et eller flere proteiner (samtidig) i histologisk kortlagt og cytologisk identificerede celler i komplekse væv, såsom hjernen, med den yderligere fordel, en plan afbildning af præ- og postsynaptiske elementer i en enkelt kopi. Derfor FRIL teknik, på trods af sine mange tekniske forhindringer, giver løfte om en række meget betydelige videnskabelige gennembrud, især for korrelationen af ​​strukturelle og funktionelle egenskaber af de enkelte synapser. I løbet af de sidste årtier, har en hel del oplysninger er indhentet på strukturen, molekylære fyldes op, og fysiologiske funktion af synapser; endnu synapser er morfologisk og molekylært meget forskelligartede afhængigt før og postsynaptiske paleje neuroner 4. Kun for en håndfuld af synapse typer var struktur og funktion undersøgelser gennemført hidtil 5-7. Det var for det meste på grund af tekniske begrænser, der forhindrede en præcis identifikation af arten af ​​de præ- og postsynaptiske elementer. Ultrastrukturelle analyse har givet kritiske indsigt i variabiliteten af postsynaptiske membran specialiseringer tværs distinkte synaptiske kontakter både hvad angår synaptisk størrelse og indhold i neurotransmitterreceptorer 6, som har en stor indflydelse på styrke og plasticitet synaptisk transmission. Ydermere er en stor mængde forskning antyder, at antallet af ionotrope glutamatreceptorer udtrykt ved forskellige typer af synapse reguleres i en afferent- og target-afhængig måde 7-10. Her er en metode skitseret, der tillader analyse af strukturen og receptor sammensætning af postsynaptiske membran specialiseringer med Acceptér definered præsynaptiske elementer og funktion. Denne fremgangsmåde drager fordel af præsynaptisk ekspression af nyligt udviklede lysfølsomme alge- proteiner, såsom channelrhodopsin2 (CHR2), og af FRIL teknik til at analysere mønsteret af postsynaptiske ekspression af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA-R) og N-methyl-D-aspartat (NMDA-R&#39;er) glutamatreceptorer. Dette demonstreres ved synapser dannet af axoner oprindelse fra den bageste thalamiske-mediale geniculate kerner (PIN / MGN) på neuroner i det indlejrede cellemasser af amygdala (ITC). ITC neuroner er små tornede GABAerge celler organiseret i klynger omkring basolaterale amygdaloidkomplekset (BLA) 11, 12. ITC neuroner er kendt for at modtage stimulerende input fra BLA vigtigste neuroner og målrette den centrale kerne (CEA), og dermed fungerer som en hæmmende gate for informationsstrømmen mellem BLA og CEA 12-15. For nylig demonstrerede vi, at detC neuroner beliggende i den medio-dorsale klynge mellem BLA og CEA får også direkte og konvergente excitatoriske input fra sensoriske thalamiske og tidsmæssige kortikale regioner, som er modificeret på frygt læring under pavlovsk auditive frygt condition 16. Frygt condition er en af ​​de bedst forståede former for associativ læring i form af hjernen mekanismer. I frygt condition, en oprindelig neutral betinget stimulus (CS, fx en tone) er parret med et afskrækningsmiddel ubetinget stimulus (US, fx en mild mund chok), hvilket resulterer i en CS-amerikansk forening og betinget frygt reaktion 17, 18. Excitatorisk input fra både thalamiske og neocorticale områder, som bærer information, der repræsenterer CS og USA henholdsvis var kendt for at konvergere på pyramideformede neuroner i den laterale kerne af amygdala (LA) og til at gennemgå plasticitet 19. Vores tidligere arbejde viste, at sanseindtryk oplysninger også i parallel videresendes til ITC neuroner <sop&gt; 16. Som et første skridt i retning af en mekanistisk molekylær analyse af individuelle sanseindtryk synapser på ITC neuroner, brugte vi en adenoassocieret virus (AAV) at udtrykke CHR2 mærket med gult fluorescerende protein (YFP). AAV blev injiceret i PIN / MGN og axonterminaler blev identificeret ved deres ekspression af CHR2-YFP. Vi brugte begge sider genereret af FRIL teknik til at vurdere tætheden af ​​postsynaptiske AMPA-R og NMDA-R&#39;er på synapser dannet med ITC neuroner ved PIN / MGN Axon terminaler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51670</td>
			<td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steretoxic frame mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia mask for mice</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>50264</td>
			<td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td>
			<td>Toohey Company, USA</td>
			<td>T25-2-900</td>
			<td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Fill glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine, IsoFlo</td>
			<td>Eickemeyer, Germany</td>
			<td>213261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controler and heating pad</td>
			<td>FHC, USA</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments, USA</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td>
			<td>Melag, Germany</td>
			<td>08754200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-26973P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fast green</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0301.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)</td>
			<td>CP Pharma, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td>
			<td>Purdure Products, USA</td>
			<td>BSOL32</td>
			<td>can be replaced by other disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other analgesics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen eye ointment</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>0191</td>
			<td>can be replaced by other eye ointments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td>
			<td>Nouvag, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutranox Suture Needle</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>12050-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde EM grade</td>
			<td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td>
			<td>AGR1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saturated picric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P6744-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H20</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4-2H2O&#160;</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>1063451000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4N NaOH</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>T198.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental</td>
			<td>Sandoz, Austria</td>
			<td>5,133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenPure ultrapure water system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>50131235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>ISMATEC, Germany</td>
			<td>ISM 930C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL, Germany</td>
			<td>MN 615 1/4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibroslicer, VT1000S</td>
			<td>Leica Microsystems, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scalpel</td>
			<td>Alcon Laboratories, USA</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other ophthalmic scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion cannula</td>
			<td>Vieweg, Germany</td>
			<td>F560088-1</td>
			<td>can be replaced by similar items from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">High-pressure&#160; Freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper carriers</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, CH</td>
			<td>528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sidol Polish</td>
			<td>Henkel, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamois skin</td>
			<td>Household supply store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole punch, 1,5mm</td>
			<td>Stubai, Austria</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denatured ethanol</td>
			<td>Donauchem, Austria</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aceton</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>9372.5</td>
			<td>CAUTION!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezing Machine HPM 010</td>
			<td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td>
			<td>HPM010</td>
			<td>not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAUTION!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vials</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>E309.1</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoCane</td>
			<td>Nalge Nunc International,USA</td>
			<td>5015-0001</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSleeve</td>
			<td>Nalge Nunc International,USA</td>
			<td>5016-0001</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage vessel</td>
			<td>Cryopal, France</td>
			<td>GT38</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-ionic detergent (Lavocid)</td>
			<td>Werner &#38; Mertz Professional, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Freeze-fracture and Replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td>
			<td>JOKE Joisten &#38; Kettenbaum, Germany</td>
			<td>SANDURET 2-K</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21&#181;</td>
			<td>JOKE Joisten &#38; Kettenbaum, Germany</td>
			<td>955932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Fracture System BAF 060</td>
			<td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td>
			<td>BAF060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic 12 well plate</td>
			<td>Gr&#246;pel, Austria</td>
			<td>14511</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>SIGMA, USA</td>
			<td>T3253</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>1,064,041,000</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS, Sodium lauryl sulfate</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5136.1</td>
			<td>CAUTION! ;&#160; can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>1,076,871,000</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5429.3</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Hybridization Oven</td>
			<td>Binder, Germany</td>
			<td>7001-0050</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunolabelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>SIGMA, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPAR Antibody</td>
			<td>Frontier Institute, Japan</td>
			<td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody</td>
			<td>ImmunoStar, USA</td>
			<td>24216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibody</td>
			<td>BBInternational,</td>
			<td>EM.GAG5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM goat anti-rabbit, 15nm; secondary antibody</td>
			<td>BBInternational,</td>
			<td>EM.GAR15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody</td>
			<td>AURION, Netherlands</td>
			<td>DAR 10nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids, 100 Parallel Bar</td>
			<td>&#160;Agar scientific, UK</td>
			<td>G2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Major Science, USA</td>
			<td>MO-RC</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioloform Powder</td>
			<td>&#160;Agar scientific, UK</td>
			<td>R1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>CAUTION! ;&#160; can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EM analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM120 TEM</td>
			<td>Philips/FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada CCD camera</td>
			<td>Soft Imaging Systems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTEM Ver. 5.2, imaging software</td>
			<td>Soft Imaging Systems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined optogenetic and freeze-fracture replica immunolabeling to examine input-specific arrangement of glutamate receptors in the mouse amygdala

Fryse-fraktur elektronmikroskopi har været et stort teknik i ultrastrukturel forskning i over 40 år. Men manglen på effektive midler til at studere den molekylære sammensætning af membraner produceret et markant fald i brugen. For nylig har der været en stor vækkelse i fryse-fraktur-elektronmikroskopiske takket være udviklingen af ​​effektive måder at afsløre integrale membranproteiner ved immunoguld mærkning. En af disse metoder er kendt som vaskemiddel-opløst Freeze-fraktur Replica immunolabeling (FRIL). Kombinationen af ​​FRIL teknik med optogenetics giver en korreleret analyse af de strukturelle og funktionelle egenskaber af centrale synapser. Ved hjælp af denne metode er det muligt at identificere og karakterisere både præ- og postsynaptiske neuroner ved deres respektive udtryk for en kodet channelrhodopsin og specifikke molekylære markører. Det karakteristiske udseende postsynaptiske membran specialisering af glutamaterge synapser muliggør endvidere, ved mærkning af ionotrope glutamatreceptorer, at kvantificere og analysere intrasynaptic fordeling af disse receptorer. Her giver vi en trin-for-trin beskrivelse af de procedurer, der er nødvendige for at forberede parret replikaer, og hvordan man immunolabel dem. Vi vil også diskutere de forbehold og begrænsninger FRIL teknik, især dem der er forbundet med potentielle prøveudtagning bias. Den høje reproducerbarhed og alsidighed FRIL teknik, når det kombineres med optogenetics, tilbyder en meget kraftfuld tilgang til karakterisering af forskellige aspekter af synaptisk transmission på identificerede neuronale mikrokredsløb i hjernen. Her giver vi et eksempel, hvordan denne fremgangsmåde blev anvendt til at opnå indsigt i struktur-funktionsforhold af excitatoriske synapser på neuroner i det indlejrede cellemasser af muse amygdala. Især har vi undersøgt ekspressionen af ​​ionotrope glutamatreceptorer på identificerede indgange elleriginated fra thalamiske posterior intralaminære og mediale geniculate kerner. Disse synapser viste sig at viderebringe sensorisk information relevant for frygt læring og at undergå plast ændringer på frygt condition.

Den FRIL teknik, når de kombineres med ekspression af optogenetic aktuatorer af mikrobiel oprindelse 21, dvs. kanaler integreret i plasmamembranen og effektivt transporteres anterogradely langs axoner, gør det muligt at undersøge kvantitativt den postsynaptiske ekspression af AMPA-R og NMDA-R ved en defineret undergruppe af synapser. Dette er vist her i axoner, der stammer fra særskilte thalamiske kerner (fx PIN / MGN) på ITC neuroner i amygdala. Denne fremgangsmåde muliggør en molekylær analyse af de enkelte sanseindtryk synapser på ITC neuroner, en gruppe af celler, der har været refraktære over for en detaljeret anatomisk og molekylær karakterisering hidtil. Fire uger efter stereotaktisk injektion af rAAV-CHR2-YFP i PIN / MGN, CHR2-YFP-positive axoner tæt innerverede LA, det amygdalostriatal overgangsområde (Astria) og den mediale paracapsular I<html> TC klynge i amygdala, et mønster i fuld overensstemmelse med tidligere opsporing studerer 16, 22. Vi har detekteret også intens guld immunolabeling for CHR2-YFP på P-ansigt axoner og terminaler i fryse-fraktur replika fra rAAV-CHR2-YFP- injicerede mus (figur 5A), men ikke i replikaer fra ikke-injicerede mus. Den postsynaptiske membran specialisering af glutamaterge synapser i en replika kan observeres som en klynge af intramembrane partikler (IMP) på E-flade på plasmamembranen 2, 23, og er ofte ledsaget af P-flade af dens præsynaptisk plasmamembran 7 (figur 5B-C). Disse træk lov til at identificere den postsynaptiske specialisering af glutamaterge synapser dannet af PIN / MGN axonterminaler (figur 5 og 6). Vi mærkede AMPA-R&#39;er med et antistof, der genkender alle fire underenheder (GluA1-4), hvorimod der ikke blev påvist NMDA-R&#39;er anvendelse af et antistof mod de væsentlige NR1 underenheden. ntent &quot;fo: holde-together.within-side =&quot; 1 &quot;&gt; På grund af manglen på redskaber til at spore på det samme replika, om disse synapser blev foretaget med dendritiske pigge og aksler af ITC neuroner, mærket vi den tilsvarende replika ansigt for μ opioid receptorer, som ITC neuroner udtrykker postsynaptisk høje niveauer af disse receptorer 24. Dette krævede identifikation af de samme postsynaptiske profiler i de to replikaer (figur 5C-F og figur 6A-D) under anvendelse af en strategi, der anvender landmærker (figur 4E) . <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> Figur 5. Påvisning af CHR2-YFP og ionotrope glutamatreceptorer på Replika af immunoguld Partikler. (A) En cross-brud Axon terminal (lyseblå) og små dele af dets P-ansigt mærket med 15 nm guldpartikler påvisning CHR2-YFP. Inden terminalen, membranen of talrige synaptiske vesikler kan observeres (sv). Bemærk specificiteten af ​​immunmærkning i vid udstrækning begrænset til plasmamembranen. Mærkning for CHR2 identificerer terminalen som hidrørende fra PIN / MGN. Terminalen danner en asymmetrisk synapse med en rygrad. Specialiseringen postsynaptiske membran (PSD) på E-ansigt viser et karakteristisk klynge af intramembrane partikler og er mærket med 5 nm guldpartikler afslører AMPA-R&#39;er. (B) P-flade af en CHR2-udtrykkende axon (mærket med 15 nm guldpartikler) er vist grænser op to dendritter, en af dem besidder to PSDs mærket med 5 nm guldpartikler afslører NMDA-R&#39;er. (CD) modstående flader af for- og postsynaptiske membraner af en PIN / MGN-ITC synapse. (C) P-flade af terminalen udtrykker CHR2 (mærket med 15 nm guldpartikler) og strækker sig over E-ansigt to dendritiske aksler, hvoraf den ene indeholder to PSDs mærket til AMPA-R&#39;er (5 nm guldpartikler). ( <strong&gt; D) Den tilsvarende P-ansigt af de to dendritter er mærket til μ-opioidreceptorer (10 nm guld partikler). (EF) Forstørrede udsigt over de områder, der er skitseret af de stiplede linier. Scale barer:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> Immunoparticles for AMPA-R&#39;er i PIN / MGN-ITC synapser blev fundet over hele IMP klynge, hvilket tyder på en homogen fordeling inden den postsynaptiske specialisering (figur 5E). En signifikant højere (uparret t-test p &lt;0,018) blev observeret tæthed af AMPA-R mærkning i PIN / MGN synapser på ITC pigge (715 ± 38 guldpartikler / um 2, n = 32) sammenlignet med synapser onto ITC dendritter (590 ± 44 guldpartikler / um 2, n = 32). Samlet er densiteten af ​​AMPA-R&#39;er i PIN / MGN-ITC synapser udviste en relativt lavvarians (Koefficient af varians, CV = 0,37) i overensstemmelse med en homogen fordeling. Immunoparticles for NMDA-R&#39;er i PIN / MGN-ITC synapser blev ofte observeret ujævnt fordelt inden postsynaptiske IMP klynger (figur 5B). Densiteten af NMDA-R mærkning var ens (uparret t-test p = 0,39) mellem PIN / MGN synapser på ITC pigge (1070 ± 153 guldpartikler / um 2, n = 8) og ITC dendritter (812 ± 183 guldpartikler / um 2, n = 9). I modsætning til, hvad der blev observeret for AMPA-R&#39;er, tætheden af ​​NMDA-R&#39;er i PIN / MGN-ITC synapser var meget variabel (CV = 0,54). <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> Figur 6. AMPA-R og NMDA-R&#39;er immunolabeling på Identificerede PIN / MGN-ITC synapser. (AB) modstående flader af for- og postsynaptiske membraner af en PIN / MGN-ITCsynapse lavet på en dendritisk rygsøjle, hvor P-flade af terminalen udtrykker CHR2 (mærket med 15 nm guldpartikler) og PSD på en dendritisk rygsøjle er mærket til AMPA-R&#39;er (5 nm guldpartikler). (CD) forstørrede billeder af de områder, der ved den stiplede linie. Disse områder er blevet drejet ca. 45 ° mod uret for at tillade en bedre visning af PSD. (E) Scatterplots af antallet af AMPA-R-partikler versus synaptisk område i ITC pigge og dendritter. I begge strukturer, har en positiv korrelation blevet observeret. (F) Scatterplots af antallet af NMDA-R-partikler mod synaptisk område i ITC pigge og dendritter. En signifikant positiv korrelation blev fundet kun i dendritiske pigge. Scale barer:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> FordiP-flade af den præsynaptiske plasmamembran ofte overlejret delvis den postsynaptiske IMP klynge, kunne vi anslår den synaptiske areal på kun 30% af synapserne (spines: betyde område 0,032 um 2, range: 0,007 til 0,063 um 2, n = 8; dendritter: 0.047 um 2, interval: 0,024 til 0,166 um 2, n = 11). Disse var i en lignende område som tidligere analyseret telencephalic glutamaterge synapser 25. I begge pigge og dendritter, blev antallet af guld Immunoparticles for AMPA-R&#39;er i de enkelte synapser positivt korreleret med den synaptiske område (Spearman, pigge: r = 0,88, dendritter: r = 0,60, p &lt;0,0001) (Figur 6E). Omvendt er antallet af guld Immunoparticles til NMDA-R&#39;er fundet at korrelere med den synaptiske område i pigge (Spearman, spines: r = 0,90, p &lt;0,002), men ikke i dendritter (r = 0,21, p = 0,29) (Figur 6F ).

Watch this Scientific Journal Video about Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala at JoVE.com

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Kombineret optogenetic og Freeze-fraktur Replica immunolabeling til at undersøge Input-specifikke Placering af glutamatreceptorer i Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic forstyrrelse af neurale aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Hurtig Mikro-iontophoresis af glutamat og GABA: et nyttigt redskab til Undersøge Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling af olfaktoriske receptor neuroner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering af Rodent centralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-foton Intracellulær Natrium Imaging Kombineret med UV-medieret Focal Uncaging af glutamat i CA1 pyramideneuroner

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Optogenetic Stimulering af hørenerven

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Udnytte Kombineret Metoder til Definer rolle plasmamembranen Delivery Under Axon Forgrening og neuronal Morfogenese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Ved hjælp af Enzym-baserede biosensorer til måling Tonic og fasiske Glutamat i Alzheimers musemodeller

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

En høj overførselshastighed Calcium-flux Assay at studere NMDA-receptorer med følsomhed over for glycin/D-Serin og glutamat

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

Muskel hastighed Recovery Cykler til at undersøge muskelmembranegenskaber

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...