Name: combined recording of mechanically stimulated afferent output and nerve terminal labelling in mouse hair follicle lanceolate endings
Uploaded: 2016-05-07T14:00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings at JoVE.com

The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.

<ol>
	<li>Cahusac, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+transient+receptor+potential+(TRP)+channel+agonists+and+antagonists+on+slowly+adapting+type+II+mechanoreceptors+in+the+rat+sinus+hair+follicle.">Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (4), 300-309 (2009).</li><li>Fagan, B. M., Cahusac, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+glutamate+receptor+mediated+transmission+at+mechanoreceptors+in+the+skin.">Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin.</a> Neuroreport. 12, 341-347 (2001).</li><li>Price, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+sodium+channel+BNC1+is+required+for+normal+touch+sensation.">The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation.</a> Nature. 407 (6807), 1007-1011 (2000).</li><li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo2+is+the+major+transducer+of+mechanical+forces+for+touch+sensation+in+mice.">Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice.</a> Nature. 516 (7529), 121-125 (2014).</li><li>Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+differences+in+the+innervation+of+mystacial+vibrissal+follicle-sinus+complexes+in+the+rat+and+cat:+a+confocal+microscopic+study.">Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study.</a> J. Comp. Neurol. 449 (2), 103-119 (2002).</li><li>Li, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+organization+of+lanceolate+mechanosensory+complexes+at+mouse+hair+follicles.">The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles.</a> eLife. 3, 01901 (2014).</li><li>Banks, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+modulation+of+synaptic-like+vesicle+recycling+in+mechanosensory+lanceolate+nerve+terminals+of+mammalian+hair+follicles.">Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles.</a> J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li><li>Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+dynamics+in+rat+fast+and+slow+motor+nerve+terminals.">Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals.">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).</li><li>Meyers, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+senses:+FM1-43+loading+of+sensory+cells+through+nonselective+ion+channels.">Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels.</a> J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).</li><li>Drew, L. J., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+is+a+permeant+blocker+of+mechanosensitive+ion+channels+in+sensory+neurons+and+inhibits+behavioural+responses+to+mechanical+stimuli.">FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli.</a> Molecular Pain. 3 (1), 1 (2007).</li><li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+reveals+membrane+recycling+in+adult+inner+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea.">FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).</li><li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+endocytosis+in+outer+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea.">Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea.</a> Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).</li><li>Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autogenic+modulation+of+mechanoreceptor+excitability+by+glutamate+release+from+synaptic-like+vesicles:+evidence+from+the+rat+muscle+spindle+primary+sensory+ending.">Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending.</a> J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).</li><li>Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gadolinium+and+FM1-43+as+blockers+of+stretch-evoked+firing+of+rat+muscle+spindle+afferents.">Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents.</a> Proc. Phys. Soc. 21 (PC22), (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons.">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

यहाँ, हम एक अपेक्षाकृत सरल तैयारी है कि तेजी से विच्छेदित किया जा सकता है विकसित किया है, कम बाल कूप घनत्व है और बालों के रोम की एक छोटी संख्या के अपेक्षाकृत चयनात्मक यांत्रिक उत्तेजना के लिए अनुमति देता है। यह electrophysiological रिकॉर्डिंग और प्रतिक्रियाओं यंत्रवत् प्रेरित बालों के रोम, परिभाषित electrophysiological प्रतिक्रियाओं के साथ यानी इमेजिंग के रोम कल्पना करने के लिए आवेदन डाई करने के लिए सहित रहते सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग, के लिए आसानी से सुलभ है। जब तक हम ऐसा नहीं किया है, इस प्रणाली को भी आसानी से एकल इकाई (एकल संवेदी अक्षतंतु) रिकॉर्डिंग के लिए संवेदी तंत्रिका उप-विभाजित और संवेदी टर्मिनल समाप्त होने आकृति विज्ञान visualizing के लिए लक्षित GFP-अभिव्यक्ति का उपयोग करने के लिए उत्तरदायी है। हम कान त्वचा की तैयारी का इस्तेमाल किया है internalization और फ्लोरोसेंट झिल्ली styryl pridinium रंगों 7 की रिहाई की विशेषताओं की जांच के लिए एक तकनीक मूल रूप से स्थानीय Vesic का अध्ययन करने के लिए विकसितsynaptic टर्मिनलों 8 में ले झिल्ली रीसाइक्लिंग। Synapses में, इमेजिंग भी आसानी से पहचान टर्मिनलों 8,9 में प्रतिक्रियाओं के एक साथ electrophysiological रिकॉर्डिंग के साथ संयुक्त है। यह इन प्रारंभिक अध्ययन है कि हम पहले उल्लेख किया रंजक भी mechanosensory अंत में 10 से भली भाँति थे में था। संस्कृति और कोक्लीअ बालों की कोशिकाओं में संवेदी न्यूरॉन्स के लिए, styryl pyridinium रंगों से लेबलिंग की ज्यादा रंगों mechanosensory चैनल, जो वे तो 11,12 ब्लॉक के माध्यम से गुजर शामिल करने लगता है। रंगों तो intracellular झिल्ली लेबल, और इस लेबलिंग अपरिवर्तनीय है। हालांकि, बालों की कोशिकाओं में यंत्रवत् 13,14 प्रेरित नहीं कर रहे हैं कि इस तरह के और मांसपेशियों स्पिंडल 15 में आइए अंत के रूप में सीटू पूरी तरह से अलग-अलग प्राथमिक संवेदी तंत्रिका टर्मिनलों, और भाले के आकार अंत यहाँ 7 में, में styryl डाई लेबलिंग झिल्ली endocytosis प्रतिबिंबित करने के लिए लगता है, के बाद से लेबलिंग प्रतिवर्ती है और mechanosensory res ब्लॉक नहीं करता7,15,16 ponses। इन अंत में चैनल पारगमन द्वारा कुछ डाई internalization पूरी तरह से इंकार नहीं किया जा सकता है, यह डाई ऊष्मायन के दौरान जारी गोलीबारी और लेबलिंग के उलटने से स्पष्ट है कि बगल में विभेदित टर्मिनलों में लेबलिंग के महान बहुमत रीसाइक्लिंग पुटिका के साथ internalization के द्वारा होता है झिल्ली। इस प्रकार, इस सरल तकनीक आसानी से पूर्व vivo ऊतकों में mechanosensory टर्मिनल कार्यों की एक श्रृंखला के संयुक्त बिजली और ऑप्टिकल निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है। सबसे व्यावहारिक तकनीकों के साथ के रूप में, reproducibility पुनरावृत्ति और अभ्यास की आवश्यकता होगी। मुख्य बिंदुओं में से कुछ के लायक विशेष ध्यान अब वर्णित किया जाएगा। विच्छेदन और रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान यह सुनिश्चित करने की तैयारी लगातार खारा पूरी तरह से 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ संतृप्त साथ भरकर रखा जाता है के द्वारा ऊतक व्यवहार्यता और अस्तित्व को अधिकतम। बालों के रोम इस प्रक्रिया के दौरान विस्थापित नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें, कआईसीएच संवेदी समाप्त गोलीबारी को प्रोत्साहित करेंगे। या तो तैयारी से थोड़ी दूरी पर एक सतत, लामिना का प्रवाह छिड़काव प्रणाली, या ध्यान बुलबुला गैस ठीक टयूबिंग के साथ अंग स्नान के माध्यम से उपयोग करें, या ध्यान से समाधान हर 20-30 मिनट ताज़ा, हर समय खारा सतह के नीचे तैयारी रखे हुए हैं। सक्शन रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड तेज इलेक्ट्रोड borosilicate pipettes सामान्य रूप से intracellular रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया संशोधित करके बनाया जाता है। सबसे पहले, ध्यान से बंद तेज युक्तियाँ # के साथ 3 संदंश तोड़ने बहुत संक्षिप्त (&lt;1 सेकंड) लेम्प बर्नर लौ के लिए जोखिम के नसों और आग पॉलिश फिट करने के लिए उचित आंतरिक व्यास देने के लिए (2.4 और 2.5 देखें)। एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात जब रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए, यह है कि विद्युत प्रतिबाधा (प्रतिरोध) इन दो इलेक्ट्रोड में दोनों को बड़ा किया और बराबर है आवश्यक है। दो इलेक्ट्रोड में निम्नलिखित पर ध्यान देकर यह मत करो। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए, यह सुनिश्चित आंतरिक व्यास तंत्रिका के लिए एक सुखद फिट, और पूर्वोत्तर की अधिकतम लंबाई हैRVE रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में तैयार की है। तंत्रिका आसपास संयोजी ऊतक का उपयोग करने के लिए प्रभावी ढंग से इलेक्ट्रोड टिप सील करने के लिए प्रयास करें। वैकल्पिक रूप से, या इसके अतिरिक्त, एक उपयुक्त आकार, वसा ऊतकों का पतला टुकड़ा की संकीर्ण अंत तंत्रिका साथ में आकर्षित। फिर, एक 50 मिलीलीटर ट्यूबिंग से जुड़ी सिरिंज के साथ ~ 1 मिनट के लिए मजबूत चूषण लगाने से इलेक्ट्रोड टिप प्लग। एक अच्छी तरह से सील टिप के लिए, मजबूत चूषण लागू करने के लिए बस प्लग की प्रभावशीलता को मजबूत करेगा और अधिक तरल या तंत्रिका में आकर्षित नहीं होंगे। तंत्रिका क्षति से बचने के लिए, तथापि, यह सुनिश्चित करें कि संयोजी ऊतक आसपास सामग्री और विदेश मंत्री कार्टिलेज पर संपीड़न से तंत्रिका cushioning है। उदासीन इलेक्ट्रोड के रूप में संभव के रूप में बारीकी से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का प्रतिरोध / प्रतिबाधा की नकल करना चाहिए। यह सावधानी से आग चमकाने वास्तव में इसे सील बिना संभव के रूप में छोटे रूप में एक छेद करने के लिए टिप से मदद की है। आगे प्रतिरोध की जरूरत है, तो adipo साथ उदासीन इलेक्ट्रोड के अंत प्लगएसई संयोजी ऊतक, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए ऊपर वर्णित के रूप में। Electroceramic यांत्रिक विस्थापन के ऊपर उत्तम नियंत्रण, दोनों स्थानिक और अस्थायी देता है। हालांकि, बिजली के कनेक्शन बनाने देखभाल - उच्च तापमान उन्हें नष्ट कर, इतना गर्म मिलाप का उपयोग नहीं करते। धातु भरी हुई epoxy गोंद का प्रयोग करें, या एक विशेषज्ञ धक्का-फिट सॉकेट आपूर्तिकर्ता द्वारा सिफारिश का उपयोग करें। यह दोनों इसे मजबूती से पकड़ और बिजली कनेक्टिविटी स्थापित करेगा। मानक epoxy राल के साथ Electroceramic करने के लिए कांच उत्तेजक जांच संलग्न। आग पॉलिश एक मानक 10 सेमी के अंत x 1.5 मिमी व्यास borosilicate ग्लास केशिका ऊतकों को नुकसान के जोखिम को कम करने के लिए electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए पैच या तेज इलेक्ट्रोड बनाने के लिए इस्तेमाल ट्यूबिंग। एकल बाल कूप उत्तेजना की आवश्यकता है, आग पॉलिश टिप एक भी बाल फिट है, और एक भी बाल खुले एपर्चर के अंदर के साथ जांच की स्थिति है। यह एक एकल बालों पर उत्तम नियंत्रण देता है। styryl DY के लिएई लेबलिंग, यह छोटे जानवरों से ऊतकों में आम तौर पर अधिक समान है। यह पूरी तरह स्पष्ट क्यों नहीं है, लेकिन इस संभावना कम उम्र के ऊतकों से कम यांत्रिक आघात और अधिक प्रभावी गहरी ऊतक हटाने को दर्शाता है। झागदार परत मिलते-जुलते विस्तार polystyrene बाल कूप ठिकानों overlying को दूर करने में पूरी तरह से। हालांकि, बहुत जोरदार जा रहा से बचने के रूप में इस तंत्रिका जाल परत और संबद्ध भाले के आकार टर्मिनलों को हटाने के जोखिम। अगर वहाँ बाल कूप आंदोलन करने के लिए बहुत कम या कोई बिजली प्रतिक्रिया, और styryl डाई आवेदन पत्र है, वसामय ग्रंथियों (पीला / सफेद) के प्रमुख लेबलिंग के लिए होता है न कि भाले के आकार अंत से बाल शाफ्ट के आधार के अलग autofluorescence (नारंगी / पीले) के साथ, ओवर-उत्साही निकासी के अंतर्निहित ऊतकों क्षतिग्रस्त हो गया है। अंत में, इमेजिंग से पहले एक डाई-chelating एजेंट का उपयोग बहुत छवि के विपरीत और अंतिम छवियों की गुणवत्ता में सुधार। इस तकनीक को आगे की पढ़ाई की एक श्रृंखला में उपयोगी हो सकता है। ये सहULD उदाहरण के लिए, शामिल हैं, mechanosensory चैनल (एस) खिंचाव पैदा प्रतिक्रियाओं के लिए जिम्मेदार के लिए स्क्रीनिंग, उम्मीदवार चैनलों के लिए चयनात्मक औषधीय ligands के साथ तैयारी incubating या इस तरह के चैनलों आनुवंशिक रूप से नष्ट कर दिया साथ माउस लाइनों स्क्रीनिंग द्वारा। उत्तरार्द्ध माउस लाइनों, Npy2r से जुड़े GFP अभिव्यक्ति 17 के साथ जैसे आनुवंशिक हेरफेर के कारण टर्मिनल आकृति विज्ञान में किसी भी बदलाव के प्रतिदीप्ति आकलन के साथ जोड़ा जा सकता है। एक अंतिम उदाहरण एसएलवी कारोबार का modulators के प्रभाव का परीक्षण करके (SLVs) इन भाले के आकार टर्मिनलों में synaptic-तरह पुटिकाओं की भूमिका की जांच कर 7 हो सकता है (सीए, मिलीग्राम, latrotoxin, ग्लूटामेट रिसेप्टर ligands) खिंचाव पैदा प्रतिक्रियाओं और styryl डाई तेज पर / रिलीज। इस प्रकार, इस नई तकनीक mechansensory तंत्रिका विज्ञान में अनुसंधान के संभावित दिलचस्प रास्ते की एक श्रृंखला को खोलता है।

संवेदी axons की भाले के आकार टर्मिनलों innervating स्तनधारियों में बालों के रोम बाल शाफ्ट उपकला चारों ओर Palisades के रूप में। उनका उद्देश्य बाल वे चारों ओर के यांत्रिक विस्थापन का पता लगाने के लिए है। वे तेजी से और धीरे धीरे अंत है कि मुख्य रूप से बालों के आंदोलन के जवाब में गतिविधि की कमी फटने का उत्पादन ज्यादा अनुकूल ढालने का मिश्रण हैं। गतिविधि बहुत जल्दी खत्म होता है जब आंदोलन, बंद हो जाता है भी जारी रखा विस्थापन की उपस्थिति में। यहाँ हम संरचना के अध्ययन के लिए correlative इस murine पंख मॉडल के विकास का वर्णन है और भाले के आकार टर्मिनलों में कार्य करते हैं। पंख इन अंत के अध्ययन के लिए कई लाभप्रद विशेषताएं है। सबसे पहले, पंख के बीच रोम और टर्मिनलों के लिए उपयोग के साथ हस्तक्षेप करने के लिए अनिवार्य रूप से त्वचा की दो परतों थोड़ा अन्य ऊतकों के साथ वापस करने के लिए वापस apposed है। त्वचा कठिन संयोजी ऊतक की न्यूनतम मात्रा के कारण बहुत पतली और आसानी से विच्छेदित है। इन्नेर्वतिओन आसानी से सुलभ और पहचाने जाने योग्य है। जबकि बाल folliclतों मौजूद हैं, वे अपेक्षाकृत कम वितरित कर रहे हैं, यंत्रवत् के रोम के व्यक्तिगत या छोटे समूहों की उत्तेजना की सुविधा। पतली अंतर्निहित त्वचीय परत औषधीय दवाओं और रंगों के साथ तंत्रिका टर्मिनलों के लिए अच्छी पहुंच देता है। इससे उन्हें विशेष रूप से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग अध्ययन के लिए आदर्श बनाता है। इमेजिंग या तो हो सकता रहने वाले टर्मिनलों में, या निर्धारण और आगे ऊतकीय प्रसंस्करण के बाद। Mechanosensory न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाएं innervating बालों के रोम पारंपरिक रूप से 1,2 दृढ़रोम कृंतक में अध्ययन किया गया है और, एक हद तक कम करने, पृथक त्वचा की तैयारी 3,4 में। ये हमारे बाल शाफ्ट के आसपास के तंत्रिका टर्मिनलों में mechanosensory शरीर क्रिया विज्ञान के सामान्य सिद्धांतों के बारे में बहुत कुछ सिखाया है। vibrissal तैयारी एक भी बाल कूप के आंदोलन पर उत्तम नियंत्रण की अनुमति देता है। हालांकि, यह इसकी जटिलता के कारण उत्पादन समझने के लिए vibrissal के रूप में मुश्किल हो सकता हैके रोम anatomically अलग mechanosensory समाप्त होने के 5 में से कम से कम 8 अलग अलग प्रकार के होते हैं और विशिष्ट electrophysiological उत्तर करने के लिए इन रूपात्मक प्रकार के मिलान अभी भी विवाद का विषय है। माउस त्वचा / saphenous तंत्रिका तैयारी सबसे अधिक बार स्पर्श और दर्द प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए अपने depilated राज्य में प्रयोग किया जाता है। इस तरह के एक तैयारी में बालों के रोम के इन्नेर्वतिओन कम जटिल है, लेकिन बालों के रोम के घनत्व, प्लस तीन अलग अलग प्रकार के कूप (गार्ड, सूआ / auchene और वक्र बाल) में इस तरह के करीब निकटता में 6 की उपस्थिति के विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने का मतलब एक भी कूप या समाप्त होने के एक प्रकार फिर से चुनौती दे रहा है। इसके अलावा, इस तैयारी के लिए एक जटिल विच्छेदन शामिल है। अंत में, दोनों vibrissal और अन्य त्वचा की तैयारी में, यह मुश्किल है, जबकि पूर्व vivo शामिल तैयारियों अभी भी जीवित हैं अंत कल्पना करने के लिए है। इस प्रकार, ऊतक सेक्शनिंग GFP व्यक्त माउस लाइनों में भी आवश्यक है। alternatively, यह इस तरह immunofluorescence के लिए निर्धारण और / या एंटीबॉडी ऊष्मायन के रूप में आगे ऊतकीय / प्रतिरक्षात्मक प्रसंस्करण की आवश्यकता है। इसलिए हम पंख तैयारी विकसित की है और इसे इस्तेमाल बाल कूप afferents के एक प्रतिबंधित आबादी से बिजली रिकॉर्डिंग बनाने के लिए और पता चलता है कि झिल्ली साइकिल चालन इन भाले के आकार अंत, styryl pyridinium रंगों की तेज इसका सबूत में होता है। अंत में, हम पता चला है कि डाई यांत्रिक संवेदनशीलता के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, यह दर्शाता है कि यह mechanotransduction चैनलों ब्लॉक नहीं करता है। सरल उत्तेजना और विश्लेषण प्रोटोकॉल के परिणामों सचित्र हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1435">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PDMS - Sylgard 184</td>
			<td style="width:111px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:989px;">Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 3 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Austerlitz Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AC Differential Preamplifier</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>Neurolog NL104A</td>
			<td>Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High/Low-pass Filter</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>Neurolog NL125</td>
			<td>Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spike Trigger</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>Neurolog NL201</td>
			<td>Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Audio Amplifier &#38; speakers</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>Neurolog NL120S</td>
			<td>Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oscilloscope</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>PM3380A</td>
			<td>We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo electroceramic&#160; wafer</td>
			<td>Morgan Electroceramics, Southampton UK</td>
			<td>PZT507</td>
			<td>Electrophysiology/computer interface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piezo electroceramic&#160; powersupply</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrophysiology Software</td>
			<td>Cambridge Electronic Design (CED)</td>
			<td>Spike2 v7</td>
			<td>Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laboratory interface</td>
			<td>Cambridge Electronic Design (CED)</td>
			<td>1401 micro</td>
			<td>Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM1-43/Synaptogreen C4</td>
			<td>Biotium/Cambridge Bioscience</td>
			<td>BT70020</td>
			<td>Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advasep 7</td>
			<td>Biotium/Cambridge Bioscience</td>
			<td>BT70029</td>
			<td>A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (&#38; other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Retiga Exi Fast 1394</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Monochrome, cooled CCD camera - basic model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Image capture and analysis software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined recording of mechanically stimulated afferent output and nerve terminal labelling in mouse hair follicle lanceolate endings

एक उपन्यास विच्छेदन और रिकॉर्डिंग तकनीक निगरानी अभिवाही गोलीबारी माउस पंख में बाल के यांत्रिक विस्थापन द्वारा पैदा करने के लिए वर्णित है। तकनीक बहुत लागत प्रभावी और सामग्री आमतौर पर सबसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगशालाओं में पाया, या आसानी से खरीदी के साथ आसानी से किया जाता है। विच्छेदन मालिकाना सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित एक सामान्य Electroceramic वेफर द्वारा प्रदान की यांत्रिक विस्थापन के साथ, सरल और तेज है। एक ही सॉफ्टवेयर भी रिकॉर्ड और electroneurogram उत्पादन का विश्लेषण करती है। पैदा तंत्रिका गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए एक वाणिज्यिक अंतर एम्पलीफायर आग पॉलिश मानक कांच microelectrodes से जुड़ा के माध्यम से है। उपयोगी टिप्स तैयारी, उत्तेजना और रिकॉर्डिंग की स्थिति रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता का अनुकूलन करने की गुणवत्ता में सुधार लाने के लिए दिया जाता है। प्रणाली बालों के रोम के कटघरा अंत के भाले के आकार टर्मिनलों के electrophysiological और ऑप्टिकल गुण परख करने की क्रिया, के रूप में रूप में अच्छी तरह के लिए उपयुक्त हैउनके औषधीय और / या आनुवंशिक हेरफेर से परिणामों। यांत्रिक उत्तेजना और एक styryl pyridinium महत्वपूर्ण डाई के साथ लेबलिंग के साथ बिजली की रिकॉर्डिंग के संयोजन का एक उदाहरण दिया जाता है।

Electrophysiological रिकॉर्डिंग व्यवस्था, उप त्वचीय वसा ऊतकों के साथ बालों के रोम को बेनकाब करने के लिए हटा दिया, चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। इस उजागर क्षेत्र के एक हिस्से चित्रा 1 बी में brightfield रोशनी में एक उच्च बढ़ाई दिखाया गया है। पंख मार्जिन और वापस पर ही इस क्षेत्र में तह एपिडर्मल सतह को उजागर करता है। इस क्षैतिज बहर करने के लिए, एक कुंद जांच (नहीं दिखाया गया है)। साथ यांत्रिक उत्तेजना के लिए एक आदर्श स्थिति में चित्रा 1C से पता चलता है कि डाई जोखिम और फिर सामने आया स्थिति के लिए मार्जिन लौटने के बाद उत्तेजित के रोम गुना की बढ़त पर बाल पदों इस स्थिति में एक styryl pyridinium डाई के साथ चिह्नित किया गया है। तैयारी से Electroneurograms आम तौर पर भी फाइबर ग्लास जांच के लगाए गए आंदोलन, सबसे बड़े आकार के प्राधिकृत व्यक्ति को शामिल करने की अनुपस्थिति (2A चित्रा में चल रहे एपी गतिविधि दिखाने <strओंग&gt; I-III)। गतिविधि के बारे में 10-20 आवेगों / सेक ( &#39;spikes&#39; ट्रेस) की दर से होता है, कोई संरचना या सुर, शक्तिप्रदता के संकेत दे रहा उत्तेजना की अवधि के बीच अंतराल के लिए ऑटो सहसंबंध के रूप में काफी फ्लैट हैं। 5 हर्ट्ज के दौरान, 100 माइक्रोन बाल शाफ्ट के यांत्रिक उत्तेजना, समग्र उत्पादन आम तौर पर 20-50 आवेगों / सेक, या 4-10 sinusoidal चक्र के अनुसार करने के लिए बढ़ जाता है। चक्र histograms का निर्माण तो प्रतिक्रियाओं के मजबूत entrainment (तथाकथित &#39;चरण-लॉकिंग&#39;) का पता चलता है (चित्रा 2Bi III))। यह काफी repeatable है, हालांकि तरंग, जिस पर प्रतिक्रियाओं बंद कर रहे हैं के चरण के आंदोलन में जो बात है, उनकी स्थिति पर निर्भर करता है यानी हिल जांच यह संपर्कों बाल। एक साधारण सीमा का पता लगाने (क्षैतिज ए में neurogram निशान को पार लाइन (I-III)) इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर कार्यक्षमता अक्सर करने के लिए एक और अधिक परिष्कृत तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता हैकील आकार और आकार की सुविधाओं भेदभाव। यह तो इन विशेषताओं द्वारा विशेष अभिवाही फाइबर की प्रतिक्रियाओं को अलग छद्म एकल इकाई रिकॉर्डिंग विश्लेषण किए जाने की अनुमति देने के लिए कर सकते हैं। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig1.jpg" /> चित्रा 1:। Electrophysiological रिकॉर्डिंग व्यवस्था और एन (3-triethylammoniumpropyl) -4 (4- (dibutylamino) styryl) Pyridinium Dibromide बाल कूप अभिवाही भाले के आकार अंत की लेबलिंग (ए) एक पंख तैयारी को एक electrophysiological पंख दिखा प्रयोग के लिए सेट अभिविन्यास, नसों का स्थान, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और वसा ऊतकों को हटाने के बाद कूप तंत्रिका वितरण के उजागर क्षेत्र। (बी) के कई बालों के रोम क्षेत्र डर्मिस करने के लिए नीचे overlying वसा ऊतकों की मंजूरी दे दी में उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी में दिखाई दे रहे हैं। अंधेरा है, आमतौर पर bilobed, आकार वसामय ग्रंथियों रहे हैं। ( <stरोंग&gt; सी) बी में बॉक्सिंग क्षेत्र) दो भाले के आकार styryl डाई एन (3-triethylammoniumpropyl) -4 (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromide और epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा यांत्रिक उत्तेजना के बाद imaged के साथ लेबल अंत दिखाने का बढ़े हुए देखने । 7 से अनुमति के साथ। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig2.jpg" /> चित्रा 2: (ए) उत्तेजना पैदा गतिविधि माउस पिन्ना से दर्ज की गई। (ऐ-III) उदाहरण, 3 अलग प्रयोगों से मानक Liley के नमकीन घोल में pinnae से निरंतर neurograms से गतिविधि का लिया। प्रत्येक रिकॉर्ड में एक 5 सेकंड खंड लगभग 5 के रूप में की sinusoidal विस्थापन का एक 3 सेकंड की अवधि सहित रिकॉर्डिंग की शुरुआत के बाद मिनट, पता चलता हैबाल शाफ्ट के मॉल संख्या। यांत्रिक उत्तेजना सतत रिकॉर्डिंग, जो आम तौर पर 1-2 घंटे के लिए चली भर में हर 30 सेकंड दोहराया गया था। कस्टम स्क्रिप्ट फ़ाइलें अलग-अलग घटनाओं है कि एक सीमा क्षैतिज कर्सर (spikes) द्वारा निर्धारित है, साथ ही प्रत्येक sinusoidal चक्र (अवधि) की शुरुआत के पार चिह्नित। (AIV) sinusoidal विस्थापन के लिए आदेश संकेत। (बी) के विश्लेषण से प्रेरणा पैदा spiking गतिविधि। (द्विपक्षीय iii) 3 ° डिब्बे में साइकिल histograms neurogram नमूने से निर्माण (ऐ-iii) क्रमश: एक गिलास जांच से बाल शाफ्ट के 5 हर्ट्ज sinusoidal विस्थापन से यांत्रिक उत्तेजना माना भाले के आकार अंत की प्रतिक्रियाओं दिखा। नोट चिह्नित चरण-लॉकिंग, चक्र के विभिन्न चरणों में, यांत्रिक जांच की शुरू करने की स्थिति में उनके सापेक्ष स्थिति पर निर्भर करता है। (BIV) सामान्यीकृत जांच विस्थापन sinusoid; वास्तविक आयाम लगभग 100 था1;। एम <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

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Neuroscience

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