Name: epigenetic regulation of cardiac differentiation of embryonic stem cells and tissues
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues at JoVE.com

The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)

1. ADN-protéines réticulation <ol><li> Fix dans 15 ml tubes cellules-ES récoltées (2 x 10 6 cellules pour ChIP régulière, 2 x 10 5 cellules Microchip), corps embryoïdes (EbS) générées à partir de cellules ES et les tissus cardiaques embryonnaires disséqués à partir d&#39; embryons E9.5 de souris (auriculo - ventriculaire canal, voie d&#39;éjection et le ventricule) en utilisant 1% de formaldéhyde dans du PBS pour les cellules ou dans perméabilisation tampon PB2 pour les tissus em...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li><li>Chen, T., Dent, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifiers+and+remodellers:+regulators+of+cellular+differentiation.">Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation.</a> Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).</li><li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation.">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li><li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity.">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li><li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+retardation+assay.">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li><li>Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cardiac+development:+a+view+from+stem+cells+to+embryos.">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).</li><li>Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+bivalent+epigenetic+marks+in+two+human+embryonic+stem+cell+lines+reveals+a+different+cardiogenic+potential.">A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential.</a> Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).</li><li>Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development.">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li><li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters.">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162, 948-959 (2015).</li><li>Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cohesin-OCT4+complex+mediates+Sox+enhancers+to+prime+an+early+embryonic+lineage.">A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage.</a> Nat Commun. 6, 6749 (2015).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q2ChIP,+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay,+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells.">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).</li><li>Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells.">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 315-326 (2006).</li><li>Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage.">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151, 206-220 (2012).</li><li>Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes.">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154, 888-903 (2013).</li><li>Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nat Commun. 6, 6033 (2015).</li></ol>

L&#39;épigénétique est devenue un domaine important de la recherche en biologie du développement. Comment un programme génétique est activé dans les cellules embryonnaires pour permettre aux cellules d&#39;acquérir une identité spécifique au sein d&#39;une lignée embryonnaire a été pendant longtemps une question clé pour les biologistes du développement. ChIP a été largement utilisé dans les dernières années, et combiné à un séquençage d&#39;ADN suivante amélioration...

<html> Le cœur est le premier organe à être formé et devenir fonctionnel dans l&#39;embryon. Le coeur est construit à partir de plusieurs lignées cellulaires qui proviennent des premier et second champs cardiaques embryonnaires 1. De stade blastocyste post-fécondation jusqu&#39;à la forme de coeur, les cellules embryonnaires doivent donc prendre de nombreuses décisions du destin cellulaire. La transcription des gènes est régulée de manière dépendante du temps et de l&#39;espace et est un processus biologique essentiel qui sous-tend la cellule décision de devenir au cours du développement embryonnaire. Un tel processus est médié par des facteurs de transcription spécifiques qui se lient à des régions régulatrices du génome comprenant les amplificateurs et les promoteurs des gènes constitutifs cardiaques. L&#39;ADN est enroulé autour histones qui sont soumis à des modifications telles que l&#39;acétylation, une méthylation, une ubiquitinylation, et / ou la phosphorylation. La modification des histones conduit à la transcription du gène refoulé, activé ou en équilibre en fonction de ce qui est modifié résidu de lysine de l&#39; histone 2. jove_content &quot;&gt; chromatine immunoprécipitation dosage (ChIP) a été mis en place il y a 3 ans et est actuellement la technologie la plus largement utilisée dans le but d&#39;identifier des cibles de soit histones modifiées ou des facteurs de transcription 4. Après immunoprécipitation des histones ou des facteurs de transcription, ADN lié peut être soit amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou séquencée. ChIP a techniquement surmonter les plus difficiles des essais de retard sur gel 5. Cependant ChIP ne signifie pas la liaison directe d&#39;un facteur de transcription à l&#39; ADN, un avantage du dosage de retard sur gel. d&#39;autre part, ChIP combinée à un séquençage d&#39;ADN a ouvert une nouvelle perspective du génome entier sur la régulation des gènes. Les cellules ES (cellules ES) récapitulent à l&#39;intérieur des corps embryoïdes ( par exemple des agrégats cellulaires.,) Ou en culture 2D les premières étapes du développement cardiaque 6 et fournissent , en principe , suffisamment de matériel pour les copeaux. En outre, les cellules ES humaines représentent un modèle cellulaire humaine de cardiogenesis bien que leur potentiel cardiogénique dépend de leur signature épigénétique 7. Aux stades ultérieurs de développement, les tissus embryonnaires de souris permettent d&#39;enquêter sur les paysages épigénétiques spécifiques nécessaires à la détermination de l&#39;identité cellulaire. Cependant, le génome est transcrit dans un type spécifique de temps et de manière cellule 8. la régulation épigénétique de la transcription génique doit être étudiée dans des régions localisées. Nous décrivons ici les protocoles de ChIP, ChIP séquentielle suivie par PCR ou séquençage en utilisant des cellules ES, des corps embryoïdes et régions embryonnaires spécifiques cardiaques. Ces protocoles permettent d&#39;étudier la régulation épigénétique de la transcription du gène cardiaque.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F8775</td>
			<td style="width:167px;">Cell Fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>Cross-link stop</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Aprotinin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>10820</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leupeptin hemisulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2882</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Protein A magnetic beads&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10001D</td>
			<td>Immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">SPRI magnetic beads</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15002-01</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Proteinase K</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25530-015</td>
			<td>Protein digestion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DNA BR standard&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Calibration range&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Syber green</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-11484</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TE buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PBX 1X</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Washing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DNase RNase free water</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10977-035</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Axygen tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td>ChIP purifiction</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibody&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Reference</td>
			<td style="width:167px;">ChIP concentration</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K27ac</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4729</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K4me1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410194 (pAb-194-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K36me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410058 (pAb-058-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K9me2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410060 (pAb-060-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K4me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410030 (pAb-030-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K27me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410069 (pAb-069-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epigenetic regulation of cardiac differentiation of embryonic stem cells and tissues

la transcription du gène spécifique est un processus biologique essentiel qui sous-tend la cellule décision de devenir au cours du développement embryonnaire. Le processus biologique est médiée par des facteurs de transcription qui lient les régions régulatrices génomiques comprenant des activateurs et des promoteurs de gènes constitutifs cardiaques. L&#39;ADN est enroulé autour histones qui sont soumis à des modifications chimiques. Les modifications des histones conduisent en outre refoulé, activé ou en équilibre la transcription des gènes, ce qui porte un autre niveau de régulation de réglage fin de la transcription du gène. Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) récapitulent au sein des corps embryoïdes (ie, des agrégats cellulaires) ou en culture 2D les étapes précoces du développement cardiaque. Ils fournissent en principe matériel suffisant pour chromatine immunoprécipitation (ChIP), une technologie largement utilisée pour identifier des régions régulatrices de gènes. En outre, les cellules ES humaines représentent un modèle de cellules humaines de cardiogenèse. Aux stades ultérieurs de développement, les tissus embryonnaires de souris permettentenquêter sur les paysages épigénétiques spécifiques nécessaires à la détermination de l&#39;identité cellulaire. Nous décrivons ici les protocoles de ChIP, ChIP séquentielle suivie par PCR ou ChIP-séquençage en utilisant des cellules ES, des corps embryoïdes et régions embryonnaires spécifiques cardiaques. Ces protocoles permettent d&#39;étudier la régulation épigénétique de la transcription du gène cardiaque.

La figure 1A illustre d&#39; abord la préparation de perles de liaison à l&#39; ADN et le contrôle de qualité en utilisant l&#39; ADN de différentes tailles (1 kb de l&#39; échelle). 0ne, 2 et 2,5 volumes (1 à 3) de billes a été ajouté à un volume de l&#39;échantillon à purifier les fragments d&#39;ADN de taille moléculaire élevée et faible. Les figures 1 B, C, D sont des exemp...

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Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Un règlement de réglage fin de la transcription des gènes à la base embryonnaire décision du destin cellulaire. Nous décrivons ici des analyses d&#39;immunoprécipitation de chromatine utilisées pour étudier la régulation épigénétique de la différenciation cardiaque des cellules souches et le développement cardiaque d&#39;embryons de souris.

Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Research

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Developmental Biology

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