Name: epigenetic regulation of cardiac differentiation of embryonic stem cells and tissues
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00
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The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)

1. DNA-Protein-Quervernetzung <ol><li> Fix in 15 - ml - Röhrchen geerntet-ES - Zellen (2 × 10 6 Zellen für regelmäßige ChIP, 2 x 10 5 Zellen für Mikrochip), Embryoidkörpern (EVG) erzeugt aus ES - Zellen und embryonalen Herzgewebe seziert von E9.5 Mausembryonen (atrioventricular Kanal, Ausflusstraktes und Ventrikel) mit 1% Formaldehyd in PBS für Zellen oder in Permeabilisierung PB2 Puffer für embryonalem Gewebe. Die Röhrchen auf Orbitalschüttler bei einer Geschwindigkeit von 60 rpm bei ...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li><li>Chen, T., Dent, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifiers+and+remodellers:+regulators+of+cellular+differentiation.">Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation.</a> Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).</li><li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation.">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li><li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity.">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li><li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+retardation+assay.">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li><li>Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cardiac+development:+a+view+from+stem+cells+to+embryos.">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).</li><li>Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+bivalent+epigenetic+marks+in+two+human+embryonic+stem+cell+lines+reveals+a+different+cardiogenic+potential.">A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential.</a> Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).</li><li>Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development.">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li><li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters.">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162, 948-959 (2015).</li><li>Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cohesin-OCT4+complex+mediates+Sox+enhancers+to+prime+an+early+embryonic+lineage.">A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage.</a> Nat Commun. 6, 6749 (2015).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q2ChIP,+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay,+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells.">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).</li><li>Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells.">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 315-326 (2006).</li><li>Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage.">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151, 206-220 (2012).</li><li>Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes.">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154, 888-903 (2013).</li><li>Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nat Commun. 6, 6033 (2015).</li></ol>

Epigenetik ist ein wichtiger Bereich der Forschung in der Entwicklungsbiologie geworden. Wie ein genetisches Programm in embryonalen Zellen aktiviert wird, um die Zellen zu erwerben eine bestimmte Identität innerhalb einer embryonalen Linie zu ermöglichen, hat eine Schlüsselfrage für Entwicklungsbiologen für lange Zeit gewesen. ChIP wurde in den letzten Jahren und kombiniert, um die DNA-Sequenzierung folgende Verbesserung der Auflösung der Sequenzierung im Großen und Ganzen verwendet....

<html> Das Herz ist das erste Organ gebildet wird und in dem Embryo funktionalen zu werden. Das Herz wird aus vielen Zelllinien aufgebaut , die von den ersten und zweiten embryonalen Herzfelder 1 entstehen. Von der nach der Befruchtung Blastozyste zu dem geformten Herz bis zu inszenieren, haben embryonale Zellen so viele Zellschicksal Entscheidungen zu treffen. Gen-Transkription wird in einem zeit- und ortsabhängig geregelt und ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Ein derartiges Verfahren ist durch spezifische Transkriptionsfaktoren vermittelt, die innerhalb des Genoms einschließlich Enhancern und Promotoren von Herz konstitutiven Genen Regulationsregionen binden. DNA ist um Histone gewickelt, die Modifikationen wie Acetylierung unterworfen sind, Methylierung, Ubiquitinierung und / oder Phosphorylierung. Histonmodifikation führt zu verdrängten, aktiviert oder balanciert Gen - Transkription in Abhängigkeit von dem Lysin - Rest von Histon 2 modifiziert. jove_content &quot;&gt; Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde Jahre angelegt 3 vor und ist derzeit das am weitesten verbreitete Technologie, um Ziele von entweder modifizierten Histone oder Transkriptionsfaktoren zu identifizieren , 4. Nach Immunpräzipitation von Histonen oder Transkriptionsfaktoren können gebundene DNA sein entweder amplifiziert durch Polymerasekettenreaktion (PCR) oder sequenziert. ChIP ist technisch herausfordernder Gelretardationsassays 5 überwinden. jedoch ChIP keine direkte bedeutet die Bindung eines Transkriptionsfaktors an DNA, ein Vorteil Gelretardation Assays. auf der anderen Seite, ChIP kombiniert, um die DNA-Sequenzierung hat eine neue genomweite Perspektive auf die Genregulation geöffnet. ES - Zellen (ES - Zellen) rekapitulieren innerhalb Embryoidkörpern (dh., Zellaggregate) oder in der 2D - Kultur die frühen Schritte der Herzentwicklung 6 und bieten im Prinzip genügend Material für ChIP. Darüber hinaus repräsentieren humane ES-Zellen, die eine menschliche Zellmodell von cardiogenesis obwohl ihr kardiogenen Potential hängt von ihrer epigenetischen Signatur 7. In späteren Stadien der Entwicklung, ermöglichen embryonale Mausgeweben für spezifische epigenetische Landschaften zur Bestimmung der Zellidentität erforderlich zu untersuchen. Jedoch wird das Genom in einer zeit- und zelltypspezifisch 8 transkribiert. Epigenetische Regulation der Gen-Transkription hat in lokalisierten Regionen untersucht werden. Hier beschreiben wir Protokolle von CHIP, gefolgt sequentielle ChIP durch PCR oder Sequenzierung unter Verwendung von ES-Zellen, Embryoidkörpern und kardialspezifisch embryonale Regionen. Diese Protokolle ermöglichen die epigenetische Regulation der Herz Gen-Transkription zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F8775</td>
			<td style="width:167px;">Cell Fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>Cross-link stop</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Aprotinin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>10820</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leupeptin hemisulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2882</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Protein A magnetic beads&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10001D</td>
			<td>Immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">SPRI magnetic beads</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15002-01</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Proteinase K</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25530-015</td>
			<td>Protein digestion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DNA BR standard&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Calibration range&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Syber green</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-11484</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TE buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PBX 1X</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Washing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DNase RNase free water</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10977-035</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Axygen tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td>ChIP purifiction</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibody&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Reference</td>
			<td style="width:167px;">ChIP concentration</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K27ac</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4729</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K4me1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410194 (pAb-194-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K36me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410058 (pAb-058-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K9me2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410060 (pAb-060-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K4me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410030 (pAb-030-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K27me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410069 (pAb-069-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epigenetic regulation of cardiac differentiation of embryonic stem cells and tissues

Spezifische Gen-Transkription ist ein wichtiger biologischer Prozess, Zellschicksal Entscheidung während der embryonalen Entwicklung zugrunde liegt. Der biologische Prozess wird durch Transkriptionsfaktoren vermittelt, die genomischen regulatorischen Regionen einschließlich Enhancern und Promotoren von Herz konstitutiven Genen binden. DNA ist um Histone gewickelt, die zu chemischen Modifikationen unterzogen werden. Modifikationen von Histonen führen weiter zu verdrängten, aktiviert oder balanciert Gen-Transkription, also eine andere Ebene der Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zu bringen. Embryonale Stammzellen (ES - Zellen) rekapitulieren innerhalb Embryoidkörpern (dh Zellaggregate) oder in der 2D - Kultur der frühen Schritte der Herzentwicklung. Sie bieten im Prinzip genügend Material für Chromatinimmunpräzipitation (CHIP), eine Technologie, im Großen und Ganzen verwendet Gen regulatorischen Regionen zu identifizieren. Darüber hinaus repräsentieren humane ES-Zellen, die eine humane Zellmodell Kardiogenese. In späteren Stadien der Entwicklung, ermöglichen embryonalen Mausgeweben fürUntersuchung spezifische epigenetische Landschaften zur Bestimmung der Zellidentität erforderlich. Hier beschreiben wir Protokolle von CHIP, sequentielle ChIP gefolgt von PCR oder Chip-Sequenzierung unter Verwendung von ES-Zellen, Embryoidkörpern und kardialspezifisch embryonale Regionen. Diese Protokolle ermöglichen die epigenetische Regulation der Herz Gen-Transkription zu untersuchen.

1A stellt zunächst die Herstellung von DNA-bindenden Perlen und Qualitätskontrolle unter Verwendung von DNA in verschiedenen Größen (1 kb Leiter). 0ne, 2 und 2,5 Volumina (1 bis 3) der Kügelchen wurde zu einem Volumen der Probe hinzugefügt hohem und niedrigem Molekulargröße DNA-Fragmente zu reinigen. Figuren 1 B, C, D sind typische Beispiele für DNA - Gelen von Voll beschallter DNA ex...

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Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Eine Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zugrunde liegt, embryonale Zellschicksal Entscheidung. Hier beschreiben wir Immunpräzipitationstests Chromatin verwendet epigenetischen Regulation sowohl der Herz Differenzierung von Stammzellen und kardialen Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen.

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Ableitung von Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolierung und Differenzierung von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus Porcine Subkutan Fettgewebes

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

Aggregate Größenoptimierung in Mikrotiterplattenvertiefungen für Abhänge-basierte Herz Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...