Name: epigenetic regulation of cardiac differentiation of embryonic stem cells and tissues
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00
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The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)

1. DNA-proteína entrecruzamiento <ol><li> Fijar en tubos de 15 ml de células cosechadas-ES (2 x 10 6 células para regular de chip, 2 x 10 5 células de microchip), los cuerpos embrioides (EBS) generadas a partir de células madre embrionarias y tejidos del corazón de embriones disecados de embriones E9.5 ratón (auriculoventricular canal, tracto de salida del ventrículo y) usando formaldehído al 1% en PBS durante o células en tampón de permeabilización PB2 de tejidos embrionarios. Coloca...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li><li>Chen, T., Dent, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifiers+and+remodellers:+regulators+of+cellular+differentiation.">Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation.</a> Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).</li><li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation.">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li><li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity.">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li><li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+retardation+assay.">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li><li>Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cardiac+development:+a+view+from+stem+cells+to+embryos.">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).</li><li>Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+bivalent+epigenetic+marks+in+two+human+embryonic+stem+cell+lines+reveals+a+different+cardiogenic+potential.">A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential.</a> Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).</li><li>Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development.">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li><li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters.">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162, 948-959 (2015).</li><li>Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cohesin-OCT4+complex+mediates+Sox+enhancers+to+prime+an+early+embryonic+lineage.">A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage.</a> Nat Commun. 6, 6749 (2015).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q2ChIP,+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay,+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells.">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).</li><li>Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells.">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 315-326 (2006).</li><li>Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage.">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151, 206-220 (2012).</li><li>Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes.">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154, 888-903 (2013).</li><li>Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nat Commun. 6, 6033 (2015).</li></ol>

La epigenética se ha convertido en un importante campo de investigación en biología del desarrollo. ¿Cómo un programa genético se activa en las células embrionarias para permitir que las células de la adquisición de una identidad específica dentro de un linaje embrionario ha sido durante mucho tiempo una cuestión clave para los biólogos del desarrollo. ChIP se ha usado ampliamente en los últimos años y combinado para la secuenciación del ADN después de la mejora en la resoluc...

<html> El corazón es el primer órgano en formarse y llegar a ser funcional en el embrión. El corazón está construido a partir de muchos linajes de células que surgen de la primera y segunda campos corazón embrionario 1. Desde el blastocisto después de la fertilización etapa de seguimiento a la forma de corazón, las células embrionarias tienen por tanto que tomar muchas decisiones del destino celular. La transcripción de genes está regulada de una manera en tiempo y espacio-dependiente y es un proceso biológico fundamental que subyace en la decisión del destino celular durante el desarrollo embrionario. Tal proceso está mediado por factores de transcripción específicos que se unen regiones reguladoras dentro del genoma incluyendo potenciadores y promotores de los genes constitutivos cardíacas. ADN se envuelve alrededor de las histonas que están sometidas a modificaciones tales como acetilación, metilación, ubiquitinylation, y / o fosforilación. Modificación de las histonas conduce a la transcripción de genes reprimidos, activado o contrapesado dependiendo de qué residuo de lisina de la histona se modifica 2. jove_content &quot;&gt; ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ha sido creada hace 3 años y es actualmente la tecnología más ampliamente utilizado con el fin de identificar los objetivos de cualquiera de las histonas modificadas o factores de transcripción 4. A raíz de la inmunoprecipitación de las histonas o factores de transcripción, DNA unido puede ser ya sea amplificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o se secuencian. chIP ha superado técnicamente más desafiantes ensayos de retardo en gel 5. sin embargo chIP no implica la unión directa de un factor de transcripción al ADN, una ventaja de ensayo de retardo en gel. por otra parte, el chip combinado para la secuenciación del ADN ha abierto una nueva perspectiva de todo el genoma en la regulación de genes. Células madre embrionarias (células ES) recapitulan dentro de cuerpos embrionarios (es decir., Agregados de células) o en cultivo 2D los primeros pasos del desarrollo cardiaco 6 y proporcionan, en principio, suficiente material para el chip. Además, las células madre embrionarias humanas representan un modelo celular humano de la cardiogenesis a pesar de su potencial cardiogénico depende de su firma epigenética 7. En etapas posteriores del desarrollo, los tejidos de embriones de ratón permiten para la investigación de paisajes epigenéticos específicos necesarios para la determinación de la identidad de la célula. Sin embargo, el genoma se transcribe de forma 8-tipo específico tiempo y celular. La regulación epigenética de la transcripción génica tiene que ser estudiado dentro de las regiones localizadas. Aquí se describe protocolos de microprocesador, microprocesador secuencial seguida de PCR o secuenciación utilizando células madre embrionarias, cuerpos embrionarios y regiones embrionarias específicas cardiacas. Estos protocolos permiten a la investigación de la regulación epigenética de la transcripción de genes cardiacos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F8775</td>
			<td style="width:167px;">Cell Fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>Cross-link stop</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Aprotinin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>10820</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leupeptin hemisulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2882</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Protein A magnetic beads&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10001D</td>
			<td>Immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">SPRI magnetic beads</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15002-01</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Proteinase K</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25530-015</td>
			<td>Protein digestion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DNA BR standard&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Calibration range&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Syber green</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-11484</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TE buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PBX 1X</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Washing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DNase RNase free water</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10977-035</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Axygen tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td>ChIP purifiction</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibody&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Reference</td>
			<td style="width:167px;">ChIP concentration</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K27ac</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4729</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K4me1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410194 (pAb-194-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K36me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410058 (pAb-058-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K9me2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410060 (pAb-060-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K4me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410030 (pAb-030-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K27me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410069 (pAb-069-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epigenetic regulation of cardiac differentiation of embryonic stem cells and tissues

la transcripción del gen específico es un proceso biológico fundamental que subyace en la decisión del destino celular durante el desarrollo embrionario. El proceso biológico está mediada por factores de transcripción que se unen regiones reguladoras genómicas que incluyen potenciadores y promotores de los genes constitutivos cardíacas. ADN se envuelve alrededor de las histonas que se someten a modificaciones químicas. Las modificaciones de las histonas conducen a más reprimida, que se activa la transcripción de genes o aplomado, con lo que otro nivel de regulación de puesta a punto de la transcripción génica. Las células madre embrionarias (células ES) recapitulan dentro de cuerpos embrionarios (es decir, los agregados de células) o en cultivo 2D los primeros pasos del desarrollo cardíaco. Proporcionan, en principio, suficiente material para la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP), una tecnología ampliamente utilizada para identificar las regiones reguladoras de genes. Además, las células madre embrionarias humanas representan un modelo celular humano de cardiogénesis. En etapas posteriores del desarrollo, los tejidos de embriones de ratón permiteninvestigar paisajes epigenéticos específicos necesarios para la determinación de la identidad de la célula. Aquí se describe protocolos de microprocesador, microprocesador secuencial seguida de PCR o chip-secuenciación utilizando células madre embrionarias, cuerpos embrionarios y regiones embrionarias específicas cardiacas. Estos protocolos permiten a la investigación de la regulación epigenética de la transcripción de genes cardiacos.

La Figura 1A ilustra la primera preparación de perlas de unión al ADN y el control de calidad utilizando ADN de diferentes tamaños (escalera de 1 kb). 0NE, se añadieron 2 y 2,5 volúmenes (1 a 3) de los granos a un volumen de la muestra para purificar fragmentos de ADN de alto y bajo tamaño molecular. Las figuras 1 B, C, D son ejemplos típicos de geles de ADN de ADN agitado cuando todo e...

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Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Una regulación de puesta a punto de la transcripción génica subyace en la decisión del destino celular embrionaria. En este documento, se describen ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina utilizados para investigar la regulación epigenética de tanto la diferenciación cardiaca de células madre y el desarrollo cardiaco de embriones de ratón.

La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Investigación

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