Name: true gene silencing: screening of a heptamer-type small guide rna library for potential cancer therapeutic agents
Uploaded: 2016-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Programme de transfert Adaptable et de la technologie Seamless par la R &amp; D, la technologie Agence japonaise pour la science et le Fonds de promotion de la recherche en sciences de la Société de promotion et d&#39;aide mutuelle pour les écoles privées du Japon Target-driven, et les numéros JSPS KAKENHI Grant 24300342 et 15H04313 .

1. Construction d&#39;un type heptamère ARNsg Library <ol><li> Sélectionnez un sous - ensemble des 16.384 (4) 7 séquences 7 nt moins que la bibliothèque à grande échelle doit être construite. NOTE: Les séquences peuvent être aléatoires et / ou conçu pour cibler des ARN cellulaires spécifiques. Pour ce dernier, trouver des structures en épingle à cheveux ressemblant à la T-bras de l&#39; ARNt dans un ARN cible à l&#39;aide d&#39;un programme approprié d&#39;ordinateur et / ou visuelle...

<ol>
	<li>Scherer, L., Rossi, J. J., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+RNA-mediated+control+of+gene+expression:+Options+and+designs.">Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs.</a> RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity. , 201-226 (2008).</li><li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+mammalian+tRNA+3&#8242;+processing+endoribonuclease+to+four-base-recognizing+RNA+cutters.">Conversion of mammalian tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).</li><li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cleavage+of+target+RNAs+from+HIV-1+with+5&#8242;+half+tRNA+by+mammalian+tRNA+3&#8242;+processing+endoribonuclease.">Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5&#8242; half tRNA by mammalian tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease.</a> RNA. 2, 523-534 (1996).</li><li>Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+heptamers+that+directs+RNA+cleavage+by+mammalian+tRNA+3&#8242;+processing+endoribonuclease.">RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).</li><li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anomalous+RNA+substrates+for+mammalian+tRNA+3&#8242;+processing+endoribonuclease.">Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease.</a> FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).</li><li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+candidate+prostate+cancer+susceptibility+gene+encodes+tRNA+3&#8242;+processing+endoribonuclease.">A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).</li><li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-terminal+half-domain+of+the+long+form+of+tRNase+Z+is+required+for+the+RNase+65+activity.">The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).</li><li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+four-base-recognizing+RNA+cutter+that+can+remove+the+single+3&#8242;+terminal+nucleotides+from+RNA+molecules.">A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3&#8242; terminal nucleotides from RNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. 32, e91 (2004).</li><li>Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+loop+structure+is+dispensable+for+substrate+recognition+by+tRNase+ZL.">The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL.</a> J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).</li><li>Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+mRNA+cleavage+by+3&#8242;+tRNase+under+the+direction+of+2&#8242;-O-methyl+RNA+heptamers.">Intracellular mRNA cleavage by 3&#8242; tRNase under the direction of 2&#8242;-O-methyl RNA heptamers.</a> Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).</li><li>Habu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HIV-1+gene+expression+by+retroviral+vector-mediated+small-guide+RNAs+that+direct+specific+RNA+cleavage+by+tRNase+ZL.">Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL.</a> Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).</li><li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-silencing+by+the+tRNA+maturase+tRNase+ZL+under+the+direction+of+small+guide+RNA.">Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA.</a> Gene Ther. 14, 78-85 (2007).</li><li>Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+TRUE+gene+silencing.">Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).</li><li>Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+utility+of+heptamer-type+sgRNA+for+TRUE+gene+silencing.">Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).</li><li>Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+inhibition+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+by+sgRNA+targeting+the+cyclin+D1+mRNA+based+on+TRUE+gene+silencing.">Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing.</a> PLoS One. 9 (114121), (2014).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+specific+miRNAs+by+naked+14-nt+sgRNAs.">Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs.</a> PLoS One. 7 (38496), (2012).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+naked+RNA+heptamer+targeting+the+human+Bcl-2+mRNA+induces+apoptosis+of+HL60+leukemia+cells.">A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells.</a> Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).</li><li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+apoptosis+of+leukemic+cells+by+TRUE+gene+silencing+using+small+guide+RNAs+targeting+the+WT1+mRNA.">Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA.</a> Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).</li><li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gene+expression+by+human+cytosolic+tRNase+ZL+through+5&#8242;-half-tRNA.">Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5&#8242;-half-tRNA.</a> PLoS One. 4, 5908 (2009).</li><li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytosolic+tRNase+ZL+can+downregulate+gene+expression+through+miRNA.">Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA.</a> FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).</li><li>Ninomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+small+guide+RNAs+for+tRNase+ZL+from+human+plasma,+peripheral+blood+mononuclear+cells,+and+cultured+cell+lines.">Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines.</a> PLoS One. 10, 0118631 (2015).</li><li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+a+heptamer-type+sgRNA+library+for+potential+therapeutic+agents+against+hematological+malignancies.">Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).</li><li>Shivarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRUE+gene+silencing+for+hematologic+malignancies.">TRUE gene silencing for hematologic malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 729 (2014).</li></ol>

In most cases, fully 2&#8242;-O-methylated, 5&#8242;- and 3&#8242;-phosphorylated heptamer-type sgRNAs dissolved in water-for-injection-grade water (in the concentration of 100 &#181;M) appear to be stable at below -20 &#176;C for at least one year, judging from their activity to induce apoptosis in cancer cells. However, their stability would change depending on their sequence, quality, and purity. In some cases, 5&#8242;- or 3&#8242;-phosphate of a part of sgRNA molecules appears to be removed spontaneously du...

Silençage génique TRUE (appelé après tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silençage génique) est l&#39; une des technologies de silençage génique ARN-1. Cette technologie a été développée en fonction des propriétés de tRNase Z L (ou 3 &#39;tRNase), ARNt 3&#39; traitement endoribonucléase: il peut cliver tout ARN cible sur un site prévu sous la direction d&#39;un petit ARN guide artificiel (ARNsg) en reconnaissant un structure pré-ARNt ou un micro-pré-ARNt formé entre l&#39;ARN cible et l&#39;ARN sg 2-9. ARNsg, qui est habituellement 7-31 nt de long, sont classées en quatre groupes, 5&#39;-demi-ARNt, l&#39;ARN heptamère, un ARN linéaire 14-nt, et de l&#39;ARN du crochet. Nous avons démontré l&#39;efficacité de silençage génique TRUE en introduisant divers sgRNAs artificiellement conçus dans des cellules vivantes 10 - 15. Nous avons également montré que sgRNAs peuvent être absorbés par les cellules wiThoout tous les réactifs de transfection et peuvent réguler négativement les taux d&#39;ARN cible et / ou induire l&#39; apoptose dans les cellules cancéreuses humaines 16 - 18. Silençage génique TRUE semble fonctionner sur le intracellulaire et le gène intercellulaire système de réseau de régulation via tRNase Z L et sgRNAs naturelles 19 - 21. Nous avons construit une bibliothèque ARNsg contenant 156 sgRNAs de type heptamère pour rechercher thérapeutiques sgRNAs potentiels de type heptamère pour les cancers du sang 22. Nous avons criblé pour l&#39;effet sur la viabilité des cellules de myélome et de leucémie humaine, et ont découvert que 20 d&#39;entre eux peuvent efficacement induire une apoptose dans au moins une des lignées cellulaires du cancer. Et 4 d&#39;entre eux ont été montré pour réduire les taux de croissance de la tumeur dans les expériences de xénogreffe de souris. Nous présentons ici un protocole de criblage d&#39;une banque d&#39;ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang. Le protocole comprend commentpour construire la bibliothèque ARNsg, comment évaluer l&#39;effet de chaque ARN sg sur la viabilité cellulaire, et la façon d&#39;évaluer davantage les sgRNAs efficaces par cytométrie en flux. Analyse pour ARN cibles cellulaires de ARNsg et l&#39; évaluation des sgRNAs efficaces dans des modèles de xénogreffes de souris peuvent être effectuées selon des méthodes classiques 17,22, bien que ceux - ci ne sont pas inclus dans ce protocole.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="948">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Custom heptamer RNA</td>
			<td style="width:167px;">Nippon Bioservice</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OligoSep Prep HC Cartridge</td>
			<td style="width:167px;">Transgenomic</td>
			<td style="width:144px;">99-3860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water-for-injection-grade Water</td>
			<td style="width:167px;">Otsuka Pharmaceutical&#160;</td>
			<td style="width:144px;">7131400A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td style="width:167px;">Wako</td>
			<td style="width:144px;">189-02025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:167px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:144px;">172012-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Penicillin-Streptomycin Mixed Solution</td>
			<td style="width:167px;">Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:144px;">26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 Well Plate</td>
			<td style="width:167px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:144px;">655 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counting Kit-8</td>
			<td style="width:167px;">DOJINDO</td>
			<td style="width:144px;">343-07623</td>
			<td>WST-8 solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate Reader, Sunrise Thermo RC-R</td>
			<td style="width:167px;">TEKAN</td>
			<td style="width:144px;">510-82851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:167px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:144px;">60819-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:167px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:144px;">P7059-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Annexin V Binding Buffer</td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:144px;">51-66121E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Annexin V</td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:144px;">51-65875X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7AAD</td>
			<td style="width:167px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:144px;">A9400-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer, FACSCalibur</td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:144px;">342973</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

true gene silencing: screening of a heptamer-type small guide rna library for potential cancer therapeutic agents

Silençage génique TRUE (appelé après tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silençage génique) est un gène d&#39;ARN dirigée silencing technologies, qui utilise un petit ARN guide artificiel (ARN sg) pour guider ARNt 3 «traitement endoribonucléase, tRNase ZL de reconnaître un ARN cible. sgRNAs peuvent être absorbés par les cellules sans réactifs de transfection et peuvent réguler négativement les taux d&#39;ARN cible et / ou induire l&#39;apoptose dans les cellules cancéreuses humaines. Nous avons criblé une bibliothèque contenant ARNsg 156 sgRNAs type heptamère de l&#39;effet sur la viabilité des cellules de myélome et de leucémie humaine, et ont découvert que 20 d&#39;entre eux peuvent efficacement induire une apoptose dans au moins une des lignées cellulaires du cancer. Nous présentons ici un protocole de criblage d&#39;une banque d&#39;ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang. Le protocole comprend comment construire la bibliothèque ARNsg, comment évaluer l&#39;effet de chaque ARN sg sur la viabilité cellulaire, et comment fucomplémen évaluer les sgRNAs efficaces par cytométrie de flux. Environ 2.000 résultats seraient censés être obtenus par criblage de la banque d&#39;ARN sg pleine échelle composée de 16.384 heptamères.

Les six sgRNAs type heptamère 5 &#39;AUCUUCA-3&#39; (H1885), 5&#39;-ACACACA-3 &#39;(H3277), 5&#39;-GGGGGCG-3&#39; (H10927), 5&#39;-GGGGCCC-3 &#39;(H10944), 5&#39;-GCCCCCG-3 &#39;(H12287) et 5&#39;-CACCAGC-3&#39; (H13260) ont été synthétisés chimiquement comme 2&#39;- O -méthyl contenant de l&#39; ARN 5 &#39;et 3&#39; des phosphates. Ces sgRNAs ont été examinés pour leurs effets sur la viabilité d&#39;une lig...

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TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

Nous présentons ici un protocole de criblage d&#39;une banque d&#39;ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang.

TRUE Gene Silencing: Projection d&#39;un heptamère type Petit Guide ARN Bibliothèque pour les agents thérapeutiques potentiels du cancer

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

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