Name: laser-assisted microdissection (lam) as a tool for transcriptional profiling of individual cell types
Uploaded: 2016-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types at JoVE.com

We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG&#180;s laboratory is supported by the University of Z&#252;rich, by a fellowship of the "Deutsche Forschungsgemeinschaft" and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the "Staatssekretariat f&#252;r Bildung und Forschung" in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).

注：このプロトコルは、組織標本、レーザ支援顕微解剖、および転写プロファイリングのためのRNA抽出を説明します。常にプロトコルのすべてのステップを通して手袋を使用しています。使用される各化学物質の安全指示を研究し、検討してください。特に、キシロールは有害であると手袋を貫通することができ、そのメタノールは毒性であることに留意してください。使用されているすべての機器の場合?...

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	<li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).</li><li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+female+gametophyte.">The female gametophyte.</a> Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).</li><li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomixis:+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization.">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li><li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomixis+-+the+asexual+revolution.">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li><li>Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+future+for+apomixis.">A bright future for apomixis.</a> Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).</li><li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+germline+formation:+molecular+insights+define+common+concepts+and+illustrate+developmental+flexibility+in+apomictic+and+sexual+reproduction.">Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction.</a> Development. 142, 229-241 (2015).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomictic+and+sexual+germline+development+differ+with+respect+to+cell+cycle,+transcriptional,+hormonal+and+epigenetic+regulation.">Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation.</a> PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarging+cells+initiating+apomixis+in+Hieractium+praealtum+transition+to+an+embryo+sac+program+prior+to+entering+mitosis.">Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis.</a> Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).</li><li>Wuest, S. E., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+applied+to+floral+tissues.">Laser-assisted microdissection applied to floral tissues.</a> Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).</li><li>Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+expression+profiling+of+rare+cell+types+as+exemplified+by+its+impact+on+our+understanding+of+female+gametophyte+development.">Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).</li><li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes.">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20, 1-7 (2010).</li><li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+plant+cells+from+tape-transferred+paraffin+sections+promotes+recovery+of+structurally+intact+RNA+for+global+gene+profiling.">Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling.</a> Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).</li><li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).</li><li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes:+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing.">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685 (2012).</li><li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors.">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li><li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages.">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li><li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species.">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li><li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments.">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li><li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).</li></ol>

プロトコルは、異なる細胞や組織の種類に適しています トランスクリプトームと組み合わせLAMは、マイクロアレイ分析により、またはRNA-のSeqは、発達または生理学的プロセス7-11,13,14を調節する遺伝子活性の特定のパターンへの洞察を得るための貴重なツールです。しかし、任意の所与の細胞型のため、この方法の適合性は、構造的な問題に決定的?...

組織レベルで行わ転写の研究では、専門性の高いまれ細胞型のトランスクリプトームは、多くの場合、より豊かな周囲の細胞によってマスクされています。このような専門性の高い細胞型のための例は、植物中の女性の生殖細胞系列（生殖細胞系列）の細胞です。女性の生殖細胞系列は、花の1,2の雌ずい群内部の種子の前駆体を胚珠を開発内で指定されています。大胞子母細胞（MMC）は、女性の生殖細胞系列の最初のセルです。それを低減大胞子のテトラッドを形成する減数分裂を受けます。合胞体に、 すなわち 、典型的には、これらの大胞子のうちの1つのみが生き残り、細胞質分裂せず、有糸分裂分割します。 3 antipodals、2助細胞、卵、および中心細胞：これらの有糸分裂は、典型的には、4つの細胞タイプで構成されて成熟した配偶体を形成し、細胞化が続いています。卵と中央細胞が堂中に2つの精細胞により受精を受ける女性の配偶子です開発シード1,2の胚と胚乳に生じさせるBLE受精。 80種子密接に関連属Boecheraで花あたりの開発-約50の一方で性的なモデル系のシロイヌナズナでは、唯一〜50個の種子は、花ごとに開発しています。このように、女性の生殖細胞系列は、このような細胞の仕様や分化などの発達過程を研究するための優れたモデル作り、わずか数専門性の高い細胞タイプで構成されています。 また、植物の再生を支配する遺伝子調節プロセスへの洞察は、印加された値とすることができます。植物では、種子（アポミクシス）を通じて両方有性と無性生殖が発生する可能性があります。有性生殖は、集団における遺伝的多様性を生成しながら、アポミクシスはマザー工場に遺伝的に同一であるクローン子孫の形成につながります。複雑な母系遺伝子型はできる限りそのため、アポミクシスは、農業と種子生産のアプリケーションのための大きな可能性を秘めています数世代3,4,5にわたって変化していない維持します。アポミクシスが自然にすべての主要な作物種では発生しませんので、作物におけるアポミクシスの工学は大きな関心の3,4,5です。無配偶生殖の根底にある遺伝的および分子的基礎は十分に詳細6で理解されていないため、この長期的な目標を達成することは困難です。 アポミクシス再生を支配する転写基礎への洞察を得るために、細胞型特異的転写プロファイリングレーザ支援顕微解剖（LAM）と次世代シーケンシング（NGS）を使用して、非常に強力なアプローチ7,8を表します 。 LAMは、最初の動物と生物医学研究のために設立されました。過去数年間にLAMは、植物生物学6,9,10に適用されています。個々の細胞や組織の種類のプロファイリングを可能にする他の方法とは対照的に、LAMは、マーカーライン6,9,10の生成を必要としません。したがって、それはアプリすることができます事前の分子の知識なしには、いかなる細胞または組織型に嘘をつきました。 LAMの別の利点は、それがあれば、セル位置および/または構造的特徴に基づいて、乾燥セクションに認識できるように、任意の細胞型に適用することが可能です。 LAMは、処理中の転写プロファイルの変化を防止する、固定された組織を使用するさらなる利点を有します。 目的の組織、 例えば、花の組織は、前パラフィンワックスに包埋した非架橋固定剤で固定されています。パラフィンワックスに埋め込 ​​みが確立されたプロトコル9,11以下、手動で行うことができます。しかし、ワックスで脱水し、浸潤のための自動化組織プロセッサの使用は、一般に、RNAの品質および組織形態の保全の観点から、より高い再現性をもたらします。樹脂中に組織を埋め込 ​​む別の戦略もうまくLAM 8によって細胞型特異的な分析のために使用されてきました。しかし、AUTOMの使用多くのサンプルは一度ハンズオン時間の最小値を必要に処理できるように、ワックスに埋め込むためated組織プロセッサは、非常に時間が効率的です。 RNAの品質の一般的に有意な損失は固定および埋め込み時に発生しませんが、ミクロトームで薄片の製造および、特には、LAMのために使用frameslidesへの実装は、RNAの質の保全のための重要なステップのまま。これは、前述されたテープ移送システムの使用は、このステップ12で、より良好なRNAの質をもたらすことが記載されています。しかし、これは、スライドの準備中に追加の時間のかかるステップを追加し、また、特別な装置を必要とします。以下に説明する最適化されたプロトコルは、再現性の遺伝子チップと次世代シーケンシング（NGS）は7,11,13,14に近づくと転写プロファイリングのために十分な品質であるRNAを産生します。また、使用されるレーザ顕微解剖顕微鏡を用いて、単離された細胞型の高純度ROUTありますinely 7,11,13,14を生産しました 。 属Boecheraはアポミクシス生殖の重要なステップを研究するための優れたモデルシステムです。 Boecheraにおいて、異なる性的及びアポミクシスアク種々の同定されており、比較のために使用することができる15,16,17分析します 。性的シロイヌナズナ及びアポミクシスBoecheraから女性の生殖細胞系列からの細胞の細胞型特異的トランスクリプトームの比較では、我々はそれによって7をアポミクシス支配する規制プロセスの新たな側面を特定する、示差的に発現している遺伝子および経路を同定しました。さらに、この研究は小さく、まれな細胞タイプの細胞型特異的転写分析のためのLAMの適合性を検証しました。すでに植物種の様々な異なる細胞型の分析のためにこのプロトコルを使用しているが、プロトコルに、種および組織特異的修飾は、特定の場合には必要とされ得ます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,009,861,000</td>
			<td>absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3686,2500</td>
			<td>100% Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease free water</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASP200 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048043624</td>
			<td>tissue processor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black cardboard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be purchased in special paper shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA- and RNAse-free Frame Slides</td>
			<td>Micro Dissect GmbH</td>
			<td></td>
			<td>1,4 &#181;m PET-membrane; can also be purchased from Leica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumond Forceps</td>
			<td>Actimed</td>
			<td>0208-5SPSF-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exsiccator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z354074-1EA</td>
			<td>Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1000&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60020</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60200</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps precision</td>
			<td>VWE</td>
			<td>232-1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide holder</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0540.01</td>
			<td>F&#228;rbek&#228;sten nach Hellendahl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass staining trough</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0570.01</td>
			<td>F&#228;rbekasten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module Leica</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EG 1150 H</td>
			<td>blocking station, similar devises are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Drying Table</td>
			<td>Medax</td>
			<td>15501</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket</td>
			<td>VWR ice bucket with lid&#160;</td>
			<td>10146-184</td>
			<td>similar buckets equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light table</td>
			<td>UVP An Analytical Jena Company</td>
			<td>TW-26&#160;</td>
			<td>white light transluminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10143562CE</td>
			<td>cut edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome blade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FEAHS35</td>
			<td>S35 microtome blade disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X882.2</td>
			<td>for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic balancing trays</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic box</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2971</td>
			<td>Plastikdose PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic lid for heating plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preparation needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-7159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse ZAP Decontamination Solution</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automated Rotary Microtome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2245</td>
			<td>similar devises are equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Loc&#160; Histo Screen Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C-1000_AQ</td>
			<td>similar cassettes of other suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 &#181;l&#160;</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td>50204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4436.2</td>
			<td>min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>process embedding cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14039440000</td>
			<td>Leica Jet Cassette I without lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF55</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted microdissection (lam) as a tool for transcriptional profiling of individual cell types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

サンプル調製とLAMは、連続工程で行われています 連続したステップの数は、LAM（ 図1）によって選択された細胞型からの転写分析のためのRNAを調製する必要があります。これは、RNA集団は、収穫後に変わらないことを確実にするために、花の収穫と直接固定することから始まります。組織は、埋?...

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Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

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