Name: differentiation of atrial cardiomyocytes from pluripotent stem cells using the bmp antagonist grem2
Uploaded: 2016-03-10T15:00:00
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यह काम एनआईएच अनुदान HL083958 और HL100398 (AKH) और 2T32HL007411-33 द्वारा समर्थित किया गया था &quot;हृदय तंत्र में कार्यक्रम: जांच में प्रशिक्षण&quot; (जेबी)।

1. सेल संस्कृति मीडिया, समाधान, और अभिकर्मकों की तैयारी। <ol><li> (MESC) मिश्रण और बाँझ छानने (0.2 माइक्रोन रोमकूप आकार) 445 मिलीलीटर ग्लासगो न्यूनतम आवश्यक मध्यम (GMEM), 50 मिलीलीटर गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (ए?...

<ol>
	<li>Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+differentiation+of+pluripotent+stem+cells.">Hepatic differentiation of pluripotent stem cells.</a> Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).</li><li>Narazaki, G., Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+and+systematic+differentiation+of+cardiovascular+cells+from+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).</li><li>Zhang, Y., Pak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Park, I. 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L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li><li>Keller, G. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+mouse+embryonic+stem+cell+based+assay+for+quantifying+cardiogenic+Induction+Efficiency.">Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+AggreWell&#8482;+plates.">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell&#8482; plates.</a> Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).</li><li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells.">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल नियमित तौर पर मुख्यमंत्रियों के एक उच्च प्रतिशत है कि आलिंद वंश के लक्षण हैं के साथ संस्कृतियों पैदा करता है। किसी भी भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, mESCs भेदभाव करने से पहले की गुणवत्ता ...

स्टेम कोशिकाओं को पैदा करने और कोशिकाओं को विशेष रूप से मानव 1-5 में बुनियादी अनुसंधान और पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन के लिए उपयोग करने के लिए मुश्किल ऊतकों की एक मेजबान से अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं। विकास के संकेत दे रास्ते के समुचित मॉडुलन वांछित प्ररूपी भाग्य के लिए स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव प्रत्यक्ष कर सकते हैं। कई प्रोटोकॉल स्टेम कोशिकाओं 6-14 से cardiomyocytes (सीएम) उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया है। इन प्रोटोकॉल आम तौर पर TFGβ superfamily (Activin, बीएमपी, और TGFβ) और Wnt बहिर्जात वृद्धि कारक है और / या छोटे अणुओं 10,12-15 के समय पर इसके माध्यम से रास्ते के मॉडुलन शामिल है। इन प्रोटोकॉल कोशिकाओं है कि मुख्यमंत्रियों बनने का प्रतिशत बढ़ाने के आम तौर पर प्रभावी रहे हैं, लेकिन विशिष्टता की कमी है, आलिंद, वेंट्रिकुलर, और नोडल / चालन प्रणाली प्रजातियों का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी पैदा होता है। विशिष्ट हृदय अध्ययन करने के लिए एक अधिक निर्देशित भेदभाव appro उपप्रकारACH आवश्यक है। Gremlin2 (Grem2, यह भी कहा जाता प्रोटीन दान और Cerberus या PRDC कम करने के लिए से संबंधित) एक स्रावित बीएमपी प्रतिपक्षी zebrafish 16 में हृदय के विकास के दौरान उचित हृदय भेदभाव और आलिंद चैम्बर गठन के लिए आवश्यक है। भेदभाव दिन 4 में Grem2 के साथ फर्क भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के इलाज, बस mesodermal मार्कर टी Brachyury और 1 की तरह Cerberus के शिखर अभिव्यक्ति के बाद, सीएमएस की पैदावार बढ़ जाती है और आलिंद वंश 14 के मुख्य रूप से कोशिकाओं का एक पूल उत्पन्न करता है। संयोजक Grem2 फर्क कोशिकाओं के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है और मानक प्रोटीन के उत्पादन की तकनीक 17 का उपयोग किया जा सकता है या व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है। यह जलीय समाधान में अत्यधिक घुलनशील है और वांछित समय बिंदु पर संस्कृतियों के लिए exogenously जोड़ा जा सकता है। भेदभाव RT-qPCR का उपयोग कर मार्करों प्रतिनिधि की अभिव्यक्ति यों तो लगाया जा सकता हैहृदय progenitors, हृदय progenitors, और प्रतिबद्ध मुख्यमंत्रियों की। इम्यूनोफ्लोरेसेंस भी पहचान करने और हृदय प्रकार की कोशिकाओं के स्थानिक वितरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अनुप्रयोग है कि शुद्ध आबादी की आवश्यकता होती है और अधिक आसानी से जब एक संवाददाता प्रणाली का उपयोग करते हुए की पहचान करने और मुख्यमंत्रियों को अलग-थलग करने के लिए किया जाता है। इस प्रयोजन के लिए, हम αMHC-DsRedNuc माउस CGR8 ते सेल लाइन का निर्माण 14 में शुरू की है। CGR8 कोशिकाओं के विकास और फीडर कोशिकाओं के बिना pluripotent रहते हैं, विस्तार और भेदभाव assays 18 की सुविधा। ते सेल लाइन हृदय-विशिष्ट अल्फा मायोसिन भारी चेन (एमएचसी या Myh6 α) जीन प्रमोटर के तहत एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत के साथ एक DsRed फ्लोरोसेंट प्रोटीन कोडिंग अनुक्रम में शामिल है। इन कोशिकाओं का उपयोग करना, सीएमएस आसानी से पहचान की और मात्रा का ठहराव, सेल छँटाई, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, दवा स्क्रीन, आलिंद और भेदभाव के तंत्र के अध्ययन के लिए अलग किया जा सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="479">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:217px;">GMEM</td>
			<td style="width:116px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:83px;">11710</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIF</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 cm Tissue Culture Plates</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 cm Bacterial Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 cm Bacterial Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gremlin 2 recombinant protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2069-PR-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile filter units</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>09-741-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X PBS, Sterile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS, no Calcium, no Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of atrial cardiomyocytes from pluripotent stem cells using the bmp antagonist grem2

स्टेम कोशिकाओं से cardiomyocytes की आबादी पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, लेकिन ये आम तौर पर मिश्रित phenotypes की कोशिकाओं निकलेगा। विशिष्ट myocyte उपप्रकार को शामिल पढ़ाई में दिलचस्पी शोधकर्ताओं ने एक अधिक निर्देशित भेदभाव दृष्टिकोण की आवश्यकता है। Grem2, एक स्रावित बीएमपी प्रतिपक्षी विवो में आलिंद चैम्बर गठन के लिए आवश्यक है कि के साथ माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ते) का इलाज करके, एक आलिंद phenotype के साथ हृदय कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या उत्पन्न किया जा सकता है। इंजीनियर Myh6-DsRed-Nuc स्टेम सेल लाइन का उपयोग पहचान, चयन, और cardiomyocytes की शुद्धि के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में embryoid निकायों फांसी ड्रॉप विधि का उपयोग Myh6-DsRed-Nuc कोशिकाओं से उत्पन्न होता है और भेदभाव दिन 4 (D4) तक निलंबन में रखा जाता है। D4 कोशिकाओं को Grem2 के साथ इलाज किया और जिलेटिन लेपित प्लेटों पर चढ़ाया जाता है। बीच D8-D10 बड़े करार क्षेत्रों और संस्कृतियों में मनाया जाता है और विस्तार करने के लिए जारी कर रहे हैं MD14 के माध्यम से ature। आण्विक, ऊतकीय और electrophysiogical विश्लेषण से संकेत मिलता Grem2 इलाज कोशिकाओं में कोशिकाओं आलिंद की तरह आलिंद cardiomyocytes के जीव विज्ञान और विभिन्न औषधीय एजेंटों के लिए उनकी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल उपलब्ध कराने विशेषताओं के अधिग्रहण।

भेदभाव करने से पहले, स्टेम कोशिकाओं कॉम्पैक्ट और सहज भेदभाव से मुक्त होना चाहिए। चित्रा 1 ए में दिखाया कोशिकाओं singularized और प्रोटोकॉल खंड के 5.1 में वर्णित के रूप में बूँदें फांसी के लिए इस...

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Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

बीएमपी विरोधी Grem2 का प्रयोग pluripotent स्टेम सेल से अलिंद cardiomyocytes के भेदभाव

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

छोटे अणु संग्राहक भेदभाव और इसके बाद ग्लूकोज भुखमरी का प्रयोग मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से उच्च शुद्ध cardiomyocytes की व्युत्पत्ति

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

मानव स्टेम कोशिकाओं से melanocytes के फीडर मुफ्त व्युत्पत्ति

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

मानव स्टेम कोशिकाओं से cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत छोटे अणु आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

माउस एमनियोटिक द्रव कोशिकाओं से स्टेम कोशिकाओं के उत्पादन के एक transposon प्रणाली का प्रयोग

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

रक्त कोशिकाओं से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल पीढ़ी सेंडाइ वायरस और centrifugation का उपयोग

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल से आदिम और निश्चित टेम Progenitors के विभेद का निर्देशन

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

मानव pluripotent की इन विट्रो भेदभाव में स्टेम कोशिकाओं Trophoblastic में कोशिकाओं

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

मानव भ्रूण या प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के तेजी से, निर्देशित भेदभाव

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

हृदय Progenitors और वेंट्रिकुलर की तरह पहले दिल क्षेत्र की पीढ़ी-मानव Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से Cardiomyocytes की तरह

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से नैदानिक संगत Corneal अंग उपकला स्टेम कोशिकाओं के कुशल और स्केलेबल निर्देशित भेदभाव

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...