Name: analysis of zebrafish kidney development with time-lapse imaging using a dissecting microscope equipped for optical sectioning
Uploaded: 2016-04-07T13:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning at JoVE.com

Мы благодарим Томас Бейтс за критическое чтение и улучшение рукописи. Мы также благодарим Кристина Эберта и Сабрина Stötzer для поддержания рыбы.

<ol>
	<li>Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Drummond, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+zebrafish+pronephros+and+analysis+of+mutations+affecting+pronephric+function.">Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function.</a> Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li><li>Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+pronephric+filtration+apparatus+in+zebrafish+requires+Nephrin,+Podocin+and+the+FERM+domain+protein+Mosaic+eyes.">Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes.</a> Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li><li>Kreidberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt-1+Is+Required+for+Early+Kidney+Development.">Wt-1 Is Required for Early Kidney Development.</a> Cell. 74 (4), 679-691 (1993).</li><li>Bollig, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish.">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li><li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros.">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).</li><li>Schnerwitzki, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+Wilms+tumor+suppressor+1+(Wt1)+exon+4+results+in+protein+isoforms+with+different+functions.">Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions.</a> Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).</li><li>Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+morpholino-based+screening+in+zebrafish.">Lessons from morpholino-based screening in zebrafish.</a> Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).</li><li>Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenesis+in+fish:+efficient+selection+of+transgenic+fish+by+co-injection+with+a+fluorescent+reporter+construct.">Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+imaging,+Part+2:+an+overview+of+fluorescence+microscopy.">Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy.</a> Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).</li><li>Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+characterization+of+a+structured+illumination+microscope.">Optimization and characterization of a structured illumination microscope.</a> Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros:+differential+control+by+wt1+and+ff1b.">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).</li><li>O'Brien, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt1a,+Foxc1a,+and+the+Notch+mediator+Rbpj+physically+interact+and+regulate+the+formation+of+podocytes+in+zebrafish.">Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish.</a> Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).</li></ol>

Автор Michael Graf является сотрудником компании Carl Zeiss Микроскопия GmbH, которая производит инструменты, используемые в настоящей статье.

Данио стал популярным модельным организмом для изучения развития позвоночных и моделирования заболеваний человека. Поскольку данио эмбрионов остаются прозрачными, развивающиеся органы, как мозг и сердце можно наблюдать с помощью стандартного препарата микроскопа. Воспользовавшись трансгенных линий с органной специфической флуоресценции позволяет оценки органогенеза на протяжении разных этапах развития внутри живых эмбрионов с помощью флуоресцентной микроскопии. Одно ограничение для визуализации структурных деталей целых органов со стандартной эпифлуоресцентной микроскопии является влияние сигналов от объектов, расположенных выше и ниже фокальной плоскости. Это вне фокуса света не только приводит к снижению контрастности и разрешения изображения, она также может скрывать важные структуры , представляющие интерес 13,14. Некоторые методы, такие как лазерного сканирования confocal-, вращающийся диск confocal- или многофотонной микроскопии были разработаны, чтобы свести к минимуму информацию вне фокуса и тем самым повые контрастность изображения, а также осевое разрешение. Альтернативный метод получения оптических срезов является лазерно и сканирование бесплатно структурированы освещение микроскопии, на основе широкого поля техника освещения , которая является и просто реализовать на регулярной микроскопом 15. Представленные здесь результаты показывают, что оптический секционирования, достигается за счет структурированного освещения, реализованный на рассекает микроскопом и в сочетании с реконструкцией сосредоточенно изображений, позволяет визуализировать структурные детали нормального и нарушения развития почек в данио. В частности, GFP-положительных клеток в wt1a морфантов рассредоточены на различных глубинах фокальных, а также изображения только в одной плоскости с не в фокусе размытый недооценить трехмерную сложность фенотипа. Для того, чтобы проследить динамику органа организации, перегруппировки или нарушения, замедленная флуоресцентная микроскопия является мощным хотя и сложной техникой. Во время покадровойвизуализации незначительные колебания или незначительные колебания температуры вызывают дрейфует в х, у, г направлении. Это требует дополнительного оборудования (климатическую камеру, антивибрационные таблицу) для получения стабильных результатов. Представленный метод использует способность рассекает микроскоп с моторизованным фокусом привода для записи покадровой изображения без дополнительных устройств. Для поддержания устойчивого фокуса, была создана стратегия автофокусировкой и перемещение сетки отпечатаны в нижней части изображения камеры была использована для коррекции х, y- нестабильности. Правильное вложение эмбриона является важным шагом в рамках протокола. Некоторые практики необходимо, чтобы поместить интересующую структуру, как можно ближе к стеклянным дном и в непосредственной близости к сетке без накладывания с ним. Основное преимущество метода заключается в том, что он является доступным и простым инструментом для непосредственного наблюдения процессов развития, таких как рост и миграция в жизниЭмбрионы в течение нескольких часов. Кроме того, рассечение микроскоп специфические преимущества, такие как большое поле зрения и расширенного рабочего расстояния облегчить изучение больших образцов, включая целые органы. Тем не менее, некоторые ограничения должны иметь в виду. Приостановка эксперимента , чтобы проверить и скорректировать позиционирование делает процедуру отнимает много времени и отсутствие надежного контроля температуры изменяет &quot;стандартное&quot; времени развития, который определяется как ч после оплодотворения при 28,5 ° С в течение данио 16. Другой потенциальной проблемой является ограниченная глубина изображения в животное, в частности, когда структура интерес находится внутри зародыша или личинки. Такая структура является данио pronephric клубочек, который расположен между сомитов и желтка. Было установлено, что предельная глубина для получения изображения клубочках составляет около 200 мкм, расстояние, которое достигается через 5 дней развития. В отличие от этого, флуоресцентные структуры, которые являются лocated ближе к поверхности животного могут быть отображены в течение более длительного времени. Например клетки печени не доступны для работы с изображениями, по крайней мере до 9 денье. Еще одним ограничением является то, что длительное обездвиживание эмбриона или личинок в агарозы и лечения Tricaine вызывают замедление роста и сердечный отек, соответственно. Так как это может мешать нормальному развитию, рекомендуется ограничить продолжительность записи в заданный промежуток времени в течение определенного периода, представляющего интерес. Для того, чтобы гарантировать, что во время визуализации структур, представляющих интерес, развиваются нормально, полезно сравнить (в конце) общий вид с этим животного выдерживают при тех же экспериментальных условиях, но без вложения и обезболивание. Запись Z-стек оптических срезов через каждые 30 минут в течение в течение 5 ч и последующего расчета расширенной глубины резкости изображений при условии, пространственную и временную информацию о ранних событиях нормального и нарушается развитие почек, которое было вызвано бу морфолино-опосредованной нокдаун wt1a. Ранее проведенные морфолино нокдаун эксперименты уже показали , что Wt1a выполняет раннее и существенную роль в формировании Предпочка В гибридизация с маркером почечной 17,18 и занятости трансгенного wt1b:. GFP линия для развития Предпочка изображений в установленное время указывает 9,10 выявили что дефицит приводит к wt1a в нарушенного клубочковой формообразования и неудачные попытки спецификации подоцита. В отличие от этих статических подходов, время покадровой записи непосредственно визуализировать динамику ранней нефрогенеза в контрольных эмбрионов и миграции GFP-позитивных клеток вдали от pronephric области в wt1a морфантов. Возможность отслеживать клетки с ошибочно доставленными с течением времени позволяет более детальный анализ фенотипа. В общем, метод, который представлен здесь обеспечивает недорогой и простой в использовании альтернативу к сложному, и менее доступными себеtups обычно используется для покадровой обработки изображений, таких как лазерный сканирующий микроскоп (оснащенного камерой и экологической таблицей антивибрационные) или легкого листового микроскопа. Описанная подпрограмма для устранения проблем дрейфа может также применяться для выполнения покадровой изображения на установках без оптических вариантов секционирования, таких как флуоресценция стереомикроскопов. Метод подходит не только для исследования развития почек, но может быть также применен для контроля нормального и дефектного морфогенеза других органов, таких как сердце или печень. Кроме того, способ может быть использован для наблюдения различные более динамические процессы в эмбриональных и взрослых модельных организмов, таких как заживление ран или регенерации.

После гаструляции, органогенеза является очередным этапом жизненного цикла человека. Она включает в себя перегруппировки, взаимодействие и очень часто миграцию клеток для производства тканей и органов. Неточности в процессах, лежащих в основе развития органов часто приводит к болезням, которые могут проявляться немедленно или же в более позднем возрасте. Таким образом, понимание органогенез является одним из основных усилий в области биологии развития и медико-биологических исследований. Для того, чтобы иметь возможность исследовать развитие того или иного органа, он должен быть виден даже через стенку тела эмбриона. Это позволяет запись пространственных и временных изменений, которые происходят в процессе развития. Кроме того, чтобы проанализировать важность факторов, участвующих в органогенеза, он должен быть восприимчив к манипулированию. Один организм , который чрезвычайно подходит для исследования органогенеза в естественных условиях является данио. Его transparобразность во время эмбрионального развития в сочетании с использованием флуоресцирующих трансгенных линий позволяет наблюдать локализации белка и динамики экспрессии, а также визуализацию внутренних органов 1. Это обеспечивает уникальное преимущество, касающееся исследования развития органов в реальном масштабе времени по сравнению с моделями млекопитающих, чьи органы недоступны для микроскопического анализа. Кроме того, различные инструменты доступны для управления эмбрионального развития данио. Кроме генерации мутантных линий, антисмысловой морфолино олигонуклеотиды (MO) могут быть использованы для нокдаун активности определенных генов, которые участвуют в развитии некоторых органов. MOs либо настроить таргетинг на сайт сплайсинга или трансляционный стартовый кодон (AUG), и тем самым мешают сплайсинга пре-мРНК или трансляции. Данио эмбриональной почки, Предпочка, является анатомически простой, но ценной моделью для изучения развития почек и функции генэс , связанных с заболеваниями почек 2. Он состоит только из двух функциональных блоков, называемых нефронов. Каждый нефрон состоит из клубочка , где фильтрация крови происходит 3. Другими компонентами являются короткой области шеи, а также сегментированные трубочки для секреции и реабсорбции растворенных веществ и каналом, который заканчивается в клоаки 4. Независимо от своей простой композиции, организация и различные типы клеток данио предпочки очень похожи на почки млекопитающих 5,6. Одним из факторов, который критически участвует в развитии почек, кодируется опухолевый супрессор гена Вильмса Wt1 7. Данио обладают двумя паралоги называемые wt1a и wt1b выражается в перекрывающийся , но не идентичной картины в процессе разработки предпочки 8. Используя трансгенного данио с GFP-меченых пронефрос структур, было показано , что полный нокдаун из wt1a &lt;/ EM&gt; или определенной формы сплайсинга приводит к тяжелым или мягких пороков развития зародышевого почки соответственно 9,10. Описанный здесь метод позволяет покадровой анализ нормальной и нарушенной нефрогенеза в данио эмбрионов с использованием флуоресцентного рассекает микроскопа, оборудованного для оптического секционирования с помощью структурированного освещения. Оптические секции в целом позволяют приобретение изображений, которые содержат только в фокусе информации. Из фокуса информации можно избежать с помощью различных подходов , таких как математические алгоритмы (например. Деконволюции), оптической конструкции (например , конфокальной лазерной сканирующей микроскопии) или комбинацией обоих (например , структурированное освещение). Для того, чтобы вызвать дефекты развития почек мы использовали антисмыслового MO против wt1a , который был введен в трансгенное данио линии (Tg (wt1b: GFP)). Эта линия показывает GFP-флуоресценцию в клубочек, шеи и переднейчасть трубочки 9,10. По сравнению с более сложных установок для покадровой записи с оптическим секционирования, таких как лазерное сканирование или легких листовых микроскопов, зум-микроскоп прост в обращении и дешевле. Кроме того, оборудование для структурированной подсветки легко можно комбинировать с обычным флуоресцентным оборудованием (например , флуоресцентной лампы, фильтры) и предлагает микроскопом рассекает специфические преимущества , такие как расширенное рабочее расстояние и большим полем зрения. Проблемы, связанные с дрейфом были решены без использования дополнительного оборудования (климатическую камеру, настольный антивибрационные), как правило, необходимое для стабильных результатов. Для коррекции фокусного дрейфа была создана стратегия автоматической фокусировки и камеры формирования изображений с отпечатками переездом сетки были использованы для подрегулировать позиционирование следующий дрейф в х или у направлении. Предложенный метод может быть также применен к микроскопам без оптических вариантов секционирования, таких как флуоресценция стерео мicroscopes и предлагает альтернативу более сложного оборудования, которое обычно используется для покадровой записи развивающихся тканей и органов динамики.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Material</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">Gene tools, LLC</td>
			<td style="width:148px;">Standard control oligo</td>
			<td style="width:252px;">Prepared&#160;control&#160;oligo</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">wt1a Morpholinos&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Gene tools, LLC</td>
			<td style="width:148px;">customized</td>
			<td style="width:252px;">Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0,5% Phenol red solution</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P0290</td>
			<td style="width:252px;">Injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">peqGOLD universal agarose</td>
			<td style="width:147px;">peqlab</td>
			<td style="width:148px;">35-1020</td>
			<td style="width:252px;">To prepare microinjection dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass capillaries&#160; (GC100F-10)</td>
			<td style="width:147px;">Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td style="width:148px;">30-0019</td>
			<td style="width:252px;">To generate injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:148px;">5242956003</td>
			<td style="width:252px;">To load the microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont forceps&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Fine Sience Tools</td>
			<td style="width:148px;">91150-20</td>
			<td style="width:252px;">To generate an opening at the needle tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:216px;">Embryo water (0.3x Danieaus&#180; solution)</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4,&#160; 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graticule 5mm / 0.05mm</td>
			<td style="width:147px;">Science Services</td>
			<td style="width:148px;">PY68039-02</td>
			<td style="width:252px;">For calculation of injection amount</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml</td>
			<td style="width:147px;">Roth</td>
			<td style="width:148px;">E305.1</td>
			<td style="width:252px;">To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml</td>
			<td style="width:147px;">Roth</td>
			<td style="width:148px;">E304.1</td>
			<td style="width:252px;">To remove excess of water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P7629</td>
			<td style="width:252px;">For suppression of melanization</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">E10521</td>
			<td style="width:252px;">To anethesize zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:147px;">Biozym</td>
			<td style="width:148px;">850111</td>
			<td style="width:252px;">For embedding&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:216px;">&#181;-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50</td>
			<td style="width:147px;">ibidi</td>
			<td style="width:148px;">81148</td>
			<td style="width:252px;">Imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel loader tips</td>
			<td style="width:147px;">Hartenstein</td>
			<td style="width:148px;">GS05</td>
			<td style="width:252px;">To orient the embryo for proper embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette puller (model P-97)</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">To generate injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:147px;">Saur Laborbedarf</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermomixer copact</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">Thermoblock for tempering the low melting agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SZ61 (Stereomicroscope)</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For injection control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axio Zoom. V16</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For embedding and imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApoTome.2 slider</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For optical sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AxioCam MRm</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For image acquisition&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ZEN 2012</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">Imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of zebrafish kidney development with time-lapse imaging using a dissecting microscope equipped for optical sectioning

Для того, чтобы понять органогенез, пространственные и временные изменения, которые происходят в процессе развития тканей должны быть записаны. Описанный здесь метод позволяет покадровой анализ нормального и нарушенного развития почек у эмбрионов данио с помощью флуоресцентного рассекает микроскопа, оборудованного для структурированного освещения и приобретения Z-стека. Для визуализации нефрогенеза, трансгенная данио (Tg (wt1b: GFP)) были использованы с флуоресцентно меченных структуры почек. Почечная дефекты были вызваны инъекции антисмысловой морфолино олигонуклеотида против гена опухоли Вильмса, wt1a фактор как известно, имеет решающее значение для развития почек. Преимущество экспериментальной установки является сочетание зум-микроскопа с помощью простых стратегий Переустановка движений в х, у, г направлении без дополнительного оборудования. Чтобы обойти фокусного дрейф, который индуцируется изменением температуры и механических колебаний, Стратегия автоматической фокусировки была применена вместо того, чтобы с использованием обычно требуется климатическую камеру. Для того, чтобы заново настроить позиционные изменения из-за ху дрейфа, использовались камеры формирования изображений с впечатывается переездом сеток. По сравнению с более сложных установок для покадровой записи с оптическим секционирования, таких как конфокальной лазерной сканирующей или световыми микроскопами листа, зум микроскоп прост в обращении. Кроме того, он предлагает рассекает микроскопом специфические преимущества, такие как высокая глубина резкости и продолжительного рабочего расстояния. Метод для изучения органогенеза, представленный здесь, также может быть использован с флуоресцентной стереомикроскопов не способных к оптической секционирования. Несмотря на то, ограничивается для высокой пропускной способностью, этот метод предлагает альтернативу более сложного оборудования, которое обычно используется для покадровой записи развивающихся тканей и органов динамики.

Покадровый микроскопия является мощным средством, чтобы наблюдать динамические биологические процессы, в течение более длительного периода времени. Часто встречающиеся проблемы во время съемки в заданный промежуток времени происходит движение в х, у, г направлении, называемый дрейф, который индуцируется изменением температуры и механических колебаний. Изложенный здесь метод позволяет Замедленная съемка флуоресцентно меченых структур у эмбрионов данио рерио или личинок на рассекает микроскопом без экологической камеры и таблицы антивибрационные. Для компенсации Оху дрейфа, образец был встроен в камеру формирования изображения с тисненой перемещения сетки (рисунок 1). Расположение определенной точки сетки , связанной с перекрестье программного инструмента был использован для возврата образца в предварительно отрегулированном положении (рис 2А). Представленные результаты были получены при использовании трансфокатора микроскопас интегрированным ползуна для оптического секционирования посредством структурированного освещения (Фигура 2В). Для непрерывного фокальной коррекции, была создана стратегия автоматической фокусировки. В рамках этой стратегии, программа автоматической фокусировки используется для поиска фокусировки на основе максимального контраста перед каждой временной точки. Это определенная таким образом фокальной плоскости затем установить в качестве плана центра для приобретения г-стека. Для того чтобы минимизировать фототоксичности в образце, проходящий свет канал светлого используется в качестве опорного канала , поскольку это позволяет достаточно короткое время выдержки в течение стадии автоматической фокусировки (фиг.2с). Метод был применен для сравнительного анализа развития почек у wt1a должного обеспечения morphant эмбрионов трансгенных данио линии (Tg (wt1b: GFP)). Во время раннего нефрогенеза эта линия показывает зеленую флуоресценцию в промежуточном мезодермы, были прародителями почек возникают из 9,10 и более поздних версийв формировании канальцев и нефрона зачатков (рисунок 3). Время покадровой записи изображения показывает , что нефрогенеза в контрольных морфолино вводят эмбрионов неизменна по сравнению с неинъецированных единиц (результаты не показаны) , и следует описанные этапы раннего развития данио почки 3. В 20 HPF развивающихся pronephric канальцев видны и на их передних кончиках, могут быть обнаружены сферические скопления клеток, представляющие собой формирующуюся нефроне зачатки. В течение последующих часов, канальцы и нефрон зачатки растут , а затем на зачатков начинают плавиться по срединной линии (рисунок 4, видео 2). В противоположность этому , нефрогенеза сильно нарушается у wt1a morphant эмбрионов. Хотя GFP-позитивные трубчатые структуры открыты в 20 часов после оплодотворения, они кажутся более размытыми и менее развиты. Кроме того, не было сформировано никакого надлежащего зачатки нефрон. Самое поразительное различие в тон контролировать эмбрионы в этот момент времени, тем не менее, является появление большого числа флуоресцирующих клеток вне развивающихся предпочки (рисунок 4, видео - 2). Впоследствии эти клетки покидают поле pronephric и мигрируют вентрально (видео 2). Развитие почек у контрольных эмбрионов и wt1a морфантов в wt1b трансгенной линии были ранее чем принимая изображения в различных точках фиксированного времени 9,10. В отличие от этого статического метода записи в заданный промежуток времени позволяет проследить динамику нормальной нефрогенеза и misrouting клеток - предшественников в почках , вызванных истощением wt1a. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig1.jpg" /> Рисунок 1: Схематическое изображение вложенном Эмбрион в коммерчески доступных палате с Переселения сетках. Блюдо имеетчетыре сетки, каждая разделена на повтор расстоянии 50 мкм, запечатленного в стекло покровное дном. Эмбриона в образ вложен с ног на голову, со структурой почек в непосредственной близости к площади наблюдения , но без накладывания с сеткой. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig2.jpg" /> Рисунок 2:. Корректировки для компенсации дрейфа во времени покадровой обработки изображений и Сетка Проекция Structured Illumination Четкое положение перемещения сетки была принесена в центре изображения (отмечены желтыми перекрестия) и служит в качестве опорной точки для последующего ху выравнивания в случае малых сдвигов. Красный прямоугольник представляет область интереса (ROI) , используемых в стратегии автоматической фокусировки (A). Оптические ва секционированияы получают путем структурированного освещения. На рисунке показана структура сетки проецируется в фокальной плоскости после правильной калибровки (B). ROI для стратегии автоматической фокусировки (красный прямоугольник) установлен , чтобы покрыть отличительные эмбриональные структуры высоко в отличие от (здесь сомитов) , которые позволяют надежную автофокусировку в структуру интересов (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig3.jpg" /> Рисунок 3: Трансгенные wt1b:. GFP Эмбрионы с зеленой флуоресценцией в развивающейся почке наложений спинного (А) или боковой передачи (B) и флуоресцентные изображения показаны с передней слева. нп, нефрона зачаток; пт, pronephric канальцев; так себеклещ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig4.jpg" /> Рисунок 4: Нокдаун wt1a Бросается эмбрионального развития почек, представителя увеличенной глубины фокусировки изображения с покадровой записи.. В контрольном морфолино инъецированных эмбрионов, развитие почек показывает нормальный ход с растущими канальцев и нефрона зачатков, которые начинают сливаться в средней линии. В противоположность этому , wt1a морфанты не способны формировать правильную нефроне зачатков и огромное количество GFP - положительных клеток находятся вне поля pronephric. (нп, нефрона зачаток; пт, pronephric трубочка). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этого фи</a>фигура. <img alt="Фильм 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/co-MO.mov" target="_blank">Справочная Видео 1. Покадровый запись нормального развития почек у управления морфолино инъецированных эмбрионов. (Щелкните правой кнопкой мыши</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/co-MO.mov" target="_blank">чтобы загрузить).</a> На видео показано , как канальцы растут и нефрон зачатки начинают сливаться. Начиная с 20 часов после оплодотворения, снимки были сделаны с интервалом 30 мин в течение 5 часов. <img alt="Фильм 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/wt1a-MO.mov" target="_blank">Справочная Видео 2. Время покадровой записи нарушенного нефрогенеза в wt1a morphant эмбрионов. (Щелкните правой кнопкой мыши</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/wt1a-MO.mov" target="_blank">чтобы скачать).</a> Видео показывает миграцию GFP-позитивных клеток из pronephric в регионе. Начиная с 20 часов после оплодотворения, снимки были сделаны в 30-мип интервалов в течение периода 5 часов.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning at JoVE.com

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Описанный здесь метод позволяет покадровой анализ развития органа у эмбрионов данио с помощью флуоресценции рассекает микроскопа, способные выполнять оптические секционирования и простые стратегии переналадки для коррекции фокусного и плоскостную дрейф.

Анализ развития данио почки с течением времени покадровой визуализации Использование рассекает микроскопа, оборудованного для оптического секционирования

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Захват восстановления тканей в данио рерио Личинки с Интерв светлого стереомикроскопия

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Анализ<em&gt; В Vivo</em&gt; Миграция клеток с использованием мобильных трансплантаций и время покадровой визуализации у эмбрионов данио рерио

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Затопленный фильтр Сэндвич Бумага для долгосрочного<em&gt; Ex Ово</em&gt; Время покадровой обработки изображений раннего куриных эмбрионов

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Метод ЗАМЕДЛЕННАЯ визуализации культивируемых Rat брыжеечные микрососудистых сетей

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Универсальный способ крепления для Long Term Визуализация данио развития

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Мульти Фотон время Замедленная съемка изображений для визуализации в режиме реального времени разработки: Визуализация миграции клеток нервной гребень в Zebrafish эмбриона

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Анализ динамики actomyosin на местных сотовых и тканевых весов использованием покадровой фильмы культурных Дрозофила яйцо камер

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Изотропная световая микроскопия и автоматизированный анализ линии клеток для каталога Caenorhabditis elegans Embryogenesis с подклеточным разрешением

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Слойный монтаж Метод для расширенного времени Lapse Конфокальная микроскопия целых эмбрионов зебрафиш

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...