Name: a step by step protocol for subretinal surgery in rabbits
Uploaded: 2016-09-13T12:30:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits at JoVE.com

Støttet af Rüdiger Foundation tilskud i 2008 og 2010 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0015 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0019 (FT), Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, kinesisk Scholarship Rådets No. 2008627116 (ZL), og en ubegrænset tilskud fra Geuder AG, Heidelberg (fig. 2). Medlemmer af H. Skottman laboratorium, er University of Tampere Finland taknemmeligt anerkendt for at levere hES afledt RPE vist i figur 2.

Etik af håndtering af dyr i oftalmologiske forskning: Vi opnåede godkendelse fra den etiske komité af det medicinske fakultet, University of Bonn, og følge de retningslinjer angivet af Foreningen for Forskning i Vision og Ophthalmology (ARVO). Desuden blev alle procedurer er godkendt af de regulerende myndigheder delstat Nordrhein-Westfalen. blev afholdt Dyr indendørs på en specialafdeling i et airconditioneret rum med temperaturer mellem 18-20 ° C, udsat for regelmæssig dagslys, i standardiserede individuelle bure med fri adgang til mad og vand. Bemærk: For at sikre dyrenes operative affinitet, er et dyr sundhed score ark fulgte som omfatter følgende endelige dyr eksklusionskriterier: 20% vægttab i forhold til vægten på optagelse; tilsyneladende cyanose af dyret; dyr kuldegysninger, har kramper eller ikke kan bevæge sig i koordination; . ataksi / paræstesi, f.eks lammer; apati; ekstrem auto lemlæstelse (hud sår, afhuggede lemmer). &lt;/ P&gt; 1. Instrument Sterilisation <ol><li> Placer genanvendelige instrumenter i ultralydsbad. </li><li> Tilføj 500 ml destilleret vand og 2 ml instrument desinfektionsmiddel. </li><li> Rene instrumenter ved at bruge sweep-funktion i 15 min. </li><li> Fjern instrumenter fra ultralydsbad og skyl grundigt med destilleret vand i 5 min. </li><li> Indsæt instrumenter autoklave og bruge standard program (sterilisation af instrumenter under 121 ºC i 20 min). </li></ol> 2. Instrument Forberedelse <ol><li> Etablere og vedligeholde et sterilt felt, ved at arbejde i et lukket rum, iført kirurgiske scrubs, maske og hår dækning. Desinficer hænder før iført sterile kirurgiske handsker. For detaljeret tilgang se 28. </li><li> Placer steriliserede instrumenter på et sterilt afdækningsstykke. </li><li> Anbring 1 ml sprøjte fyldt med 40 mg triamcinolon fastgjort til en 27 G nål til injektion, 10 ml sprøjte med Balance saltopløsning (BSS) og 5 ml sprøjte of smøremiddel på drapere. </li><li> Placer 3-0 silke, 7-0 Vicryl, okulære pinde (at stoppe konjunktival / skleral blødning), twister gaze svampe sårlukning strips (at fiksere vitrektomi spids slanger), og lysekrone endoillumination fiber ledning på en drapere. </li><li> Pak 25 G lysekrone endoilluminator og oprette forbindelse til lys maskine ved hjælp af sterile teknikker (se trin 2.1). Tilslut vitrektomi sæt med høj hastighed vitrector og Venturi kassette til vitrektomi maskine ved hjælp af sterile teknikker (se trin 2.1). </li><li> Åbne 500 ml BSS flaske og forbinde løsning på Venturi Kassette ifølge producentens instruktioner. </li></ol> 3. Udarbejdelse af Anæstesi og Positionering af Animal <ol><li> Afvejes dyr at sikre nøjagtig medicindosering. </li><li> Forbered intramuskulær (IM) anæstesi ved hjælp en sprøjte med 27 G nål indeholdende 0,35 mg / kg ketamin og 0,25 mg / kg medetomidin til start. Vend sprøjten for at blande. </li><li> Forbered 2 sprøjter med 1/3 than doser for at opretholde anæstesi under operationen. </li><li> Forbered sprøjte indeholdende 20 ml 5% glucoseopløsning og 18 G nål til subkutan injektion som en intravenøs infusion alternativ. </li><li> Gav 3 x 1 dråbe mydriatisk øjendråber før vitrektomi for pupildilatation. </li><li> Cover kanin med tæppe til at berolige før anæstesi injektion, injicerer på bagbenet (Glutealmuskulaturen) og massage omkring injektionsstedet i 30 sek. Bemærk: Første skud af IM anæstesi varer omkring 1 - 2 ud hr. afhængigt af kaninens størrelse, drug tolerance, fedtlag, stress og legemstemperatur. Det første tegn på anæstesi fading væk er en nystagmus (skal overvåges af kirurgen), efterfølgende injektioner sidste omkring 30 - 45 min. </li><li> Bekræft korrekt anæstesi, ved at verificere hypnose, hyporefleksi, analgesi og muskelafslapning af dyret. </li><li> Giv subkutan injektion (Pt. 3.3) i nakken hudfold, når kaninen er bevidstløs. </li><li> Tilføj methylCellulose smøremiddel hver 5 - 10 min i betjent øje, tilføjer smøremidler og tape låg i ikke-opererede øje. </li><li> Placer dækket kanin på operationsbordet draperet med et dæksel, såsom en bomulds tæppe i en optimal position (næse lidt forhøjet gennem en form af tæppet, så det er i niveau med øjenoverfladen) under kirurgisk mikroskop. Juster øjet vinkelret på mikroskopobjektglas. </li><li> Sørg for korrekt krop kernetemperatur hjælp rektal termometer (normotermi 39 ± 1 ºC) 29. </li><li> Cut øjenvipper bruger saks (nogle salve på bladet) for at reducere postoperative infektioner. </li><li> Desinficere øjet med 2 - 3 dråber 0,1 g / ml povidon-iod topisk i 1 minut og skyl med sterilt BSS. </li><li> Dæk øje med sterilt afdækningsstykke med forskårne åbning i midten for øjet og derefter dække med (sticky) kirurgisk snit afdækningsstykke 12 x 17 cm. </li></ol> 4. Vitrektomi <ol><li> Proptose og sikkert øje med 3-0 silke hjælp inverted caliper og udføre en konjunktival peritomi. <ol><li> Incise bindehinden med en Vannas saks tæt på limbus men langt nok fra blodkarrene (~ 1 mm afstand). </li><li> Dissekere bindehinden ved at oprette et &quot;T-cut&quot;. Først forstørre peritomi med saksen parallelt med limbus og derefter incise conjunctiva lodret i form af en &quot;T&quot; for omkring 6 - 7 mm. Adskil forsigtigt bindehinde ligeud. </li></ol></li><li> Udfør en sklerotomi ved hjælp af en 23 G microvitreoretinal (MVR) klinge klokken 8 på højre øje / OD (klokken 4 om venstre øje / OS) ved forsigtigt at indsætte den skarpe spids af bladet i retning mod den optiske nerve. trække langsomt klingen i samme retning og undgå udvide sklerotomi. </li><li> Indsæt og sutur brugerdefinerede side port-infusion kanyle 27 ved hjælp af 7-0 silke sutur og sæt intraokulært tryk (IOP) ved 24 mmHg. </li><li> Udfør en sklerotomi med 25 G fladt hoved trocar klokken 2 om OD (10 o &#39;; Ur på OS) svarende til trin 4.2. </li><li> Sæt 25 G lysekrone lys i fladt hoved trocar, fiksere med sticky tape og tænde lyskilden ved ca. 30%. </li><li> Hvis det er nødvendigt, fjerne ødematøs corneaepitelet ved hjælp af en # 20 skalpel for bedre intraokulær visualisering. </li><li> Udfør en sklerotomi lignende til trin 4,2 ved 10-tiden om OD (klokken 2 om OS), (for) sted U-formet 7-0 suturer omkring sklerotomi uden at binde knude, og indsæt vitrektomi cutter tip. </li><li> Start vitrectomy 30 omkring indgangsporten, derefter fortsætte over optiske disk og fibrae medullares ved hjælp af høj hastighed vitrector ved at skære glaslegemet i små stykker på max. 2.000 - 3.000 nedskæringer / min, opsugning ved max. 200 mmHg ved hjælp af den angivne parameter opsætning af vitrektomi maskine (tabel 1) </li><li> Udfør en posterior glaslegemeløsning (PVD) ved at adskille glaslegemet fra retina ved at holde den høje hastighed vitrector over bageste pol and (hvis muligt forsigtigt) overlegen af skiven 31, mens opsugning kun på max. 200 mmHg uden at skære. </li><li> Injicere ca. 50 pi (20 mg) triamcinolon eller fortyndet fluorescein (ca. 0,1 mg / ml) intravitrealt at visualisere og lette (næsten total) fjernelse af det flydende glaslegemet over bageste pol og midperiphery under vitrektomi. Undgå passage over under linsen. Indrykning at barbere perifer glaslegemet med en (faglært) assistent anbefales, hvis der ønskes gas tamponade. </li><li> Der tilsættes 20 enheder / ml heparin og 0,5 mg epinephrin til en slutkoncentration på 0,001 mg / ml i BSS infusionsopløsningen parallelt eller efter trin 4.10. Bemærk: Som heparin / adrenalin ikke injiceres intraokulært deres virkninger er forsinket afhængig infusion flow. </li></ol> 5. Loading Shooter Bemærk: Den her beskrevne arbejde ikke falder ind under de læresætninger Helsinki-deklarationen; den ikke fører humane patienter. Her standard RPE celler blev isoleret fra føtale humane øjne, dyrkede og differentieret på ubestrøget 10 um tyk polyester (PET) indsætter ifølge vores tidligere offentliggjort protokol 14. En tilladelse til at arbejde med den menneskelige føtal materiale blev opnået fra den etiske komité for universitetet i Bonn. Alternativt blev hES-RPE afsendt fra Skottman lab (manuskript i prep.), Hvor de blev dyrket ifølge teknikken beskrevet af Vaajasaari et al 32.; for disse celler der er opnået tilladelse fra R. Koch Institut, Berlin, Tyskland. <ol><li> Skyl cellekultur før forberedelse af implantatet 3x med oftalmologiske klasse BSS. </li><li> Fyld en standard cellekultur parabol (100 x 20 mm) med 10 ml oftalmologiske klasse BSS. </li><li> Tilsæt celledyrkningsinsert i BSS og centrere skålen under et lysmikroskop. </li><li> Punch et 2,4 x 1,1 mm implantat med en stump, oval, skræddersyet nål for at opnå en flad, bønne-formet substratmed to lange kanter og to runde kanter. </li><li> Oversvømme forsigtigt nålen gennem den anden port med BSS til at skylle ud implantatet i BSS fyldt specialfremstillede fyldestationen (figur 1). </li><li> Eventuelt skære en runde ende af implantatet (&lt;0,5 mm), blot for at opnå en tredje kant. </li><li> Sørge for, at implantatet er i den rigtige orientering ved at sikre, at monolaget er vendt på cellen bærer. For at ændre positionering omhyggeligt bruge to skalpeller. </li><li> Skub implantatet forsigtigt og helt ind i skytten instrument under anvendelse nåleholderen indtil alt implantatet er fastgjort inde i spidsen. Stemplet skal forblive tilbagetrukket. </li><li> Hold &quot;lastet&quot; shooter tip i lastning station under BSS indtil det øjeblik af implantation. </li></ol> 6. Implantation <ol><li> Tilgang neurale nethinde med udskydelige 41 G subretinal injektion nål forbundet til en gastæt sprøjte (sikre, at er blevet evakueret alle luftboblerfra slangen!). </li><li> Injicer BSS (med calcium og magnesium / CM) subretinalt og dermed skabe en bleb nethindeløsning (BRD) på ca. 2 - 3 i skive diameter (DD). To brd per øje kan hæves sikkert. </li><li> Forstørrelse retinotomy til 1,5 mm med lodrette 23 G VR-saks. Subretinarummet er nu tilgængelig til implantering eller yderligere manøvrering. </li><li> Forlæng sklerotomi (præcist) med en 1,4 mm snit kniv til 20 G tilgang. </li><li> Forsøg passerer gennem sklerotomi ved hjælp af en 20 G shooter dummy, forstør efter behov for at sikre en jævn, men lun overgang af læsset shooter. </li><li> Pass med den indlæste shooter 27 gennem sklerotomi ideelt på 24 mmHg. </li><li> Tilgang retinotomy kant og skubbe implantatet subretinalt fra en Epiretinal position. </li><li> Juster implantatet med halvt lukkede 23 G saks, pincet eller 41 G nål for at sikre det er placeret godt under retina- rimelighed væk fra retinotomy. </li></ol> 7.Afslutning Operation <ol><li> Fjern 25 G lysekrone og infusionskanyle. </li><li> Sutur alle sclerotomies. </li><li> Injicer 25 pi (10 mg) triamcinolon ved 8 kl sklerotomi (før suturering sidste sklerotomi). </li><li> Check / justere IOP ved palpation og injicere BSS via 30 G kanyle / sprøjte, hvis det er nødvendigt. </li><li> Sutur bindehinde med 7-0 Vicryl. </li><li> Fjern proptosing 3-0 silke slynge langsomt (Undgå dyb orbitale venøse plexus!). </li><li> Tilføj dexamethason / antibiotisk salve under låget. </li><li> Position i 1 time dækket med tæppe med betjente øjet opad (w / o gas) eller ned (med luft / gas). </li><li> Efterlad ikke dyr uden opsyn, indtil det genvinder tilstrækkeligt bevidsthed til at opretholde brystbenslymfeknuderne recumbence. </li><li> Må ikke transportere kanin før bedøvelsen svinder helt, kan dette fremskyndes ved at indsprøjte medetomidin vende middel lig med mængden af ​​medetomidin givet. </li></ol> 8. Postoperativ Animal Care <ol><li> Holdekaniner under passende betingelser (temperatur, lys, mad, vand, plads, osv.) og nøje overvågning på en specialafdeling. </li><li> Sørg for, at dyret er godt udhvilet, dvs.., Ingen længere perioder mad eller vand afsavn. </li><li> Kig efter eventuelle sår eller skader, især på injektionssteder. </li><li> Hold sår tørre for at undgå infektioner. Giv antibiotika, når der er mistanke om infektion: dexamethason 1 mg / g, neomycin sulfat 3.500 IU / g, polymyxin B-sulfat 6.000 IU / g salve blev påført to gange dagligt i 1 uge postoperativt på øjenoverfladen. </li><li> Tilføj dexamethason / antibiotisk salve til næste 7 dage postoperativt to gange dagligt i bedre okulær overflade regenerering og reduceret post-operative smerter. </li><li> Giv systemiske analgetika (Carprofene 4 mg / kg to gange daglig) til indledende 48 timer. </li><li> Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystbenslymfeknuderne recumbence. </li><li> Må ikke returnere et dyr, derhar gennemgået kirurgi til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt. </li><li> dyr må ikke udsættes for unødig belastning. </li></ol> 9. SLO / SD OLT-Vejledning <ol><li> Forberede og injicere intramuskulært (IM) anæstesi ved hjælp en sprøjte med 27 G nål indeholder 0,175 mg / kg ketamin og 0,125 mg / kg medetomidin til start. Vend sprøjten for at blande. </li><li> Tilføj et smøremiddel mindst hver 5 min til moisturize øjet og opretholde klare SD OLT billeddannelse, eventuelt en tilpasset kontaktlinse kan anvendes. </li><li> Vedhæft en stål platform til nakkestøtten for at stabilisere dyret i den ønskede position. </li><li> Placer kanin på stål platform, placere sit øje vinkelret på sonden. </li><li> Hold kanin hoved fra den nedre kindbenet (mandibel) undgåelse luftrøret. </li><li> Tilt dyrets hoved med ca. 45º mod SD OLT sonde til at optimere synsvinklen på implantatet. </li><li> Brug en 30 graders linse og følgende parametre for optimal oktober imaging [HS]: 30 grader indstillinger for enkelt linje scanner med ART indstillet til 100 (gennemsnit) og 20 x 20 graders indstillinger for volumen scanninger med ART indstillet til 15; højopløsningstilstand er ikke påkrævet. </li><li> Brug SLO infrarød reflektans billeddannelse at finde brændplanet af implantatet (figur 2A.); optimal fokus er nået, når (alle) implantatet kanter er skarpe 14. </li><li> Tilføj dexamethason 1 mg / g, neomycin sulfat 3.500 IU / g, polymyxin B-sulfat 6.000 IU / g salve under låget, når færdig. </li></ol>

RB, BVS, ZL, NE og Geuder AG har indgivet en europæisk patentansøgning på skytten. NB er ansat i Geuder AG. Offentliggørelse gebyrer for denne video-artikel blev betalt af Geuder AG.

Ved hjælp af en kanin model er en sikker og reproducerbar metode præsenteret for transvitreal levering af dyrkede RPE på celle luftfartsselskaber i subretinarummet med en specialdesignet shooter instrument. Den beskrevne metode giver en kort / optimeret kirurgisk teknik til nem læring, da det indebærer standard teknikker i vitrektomi med subretinal manøvrer. Outcome lettes meget ved en ren vitreoretinalt grænseflade, og intraokulær infusion, der undgår fluid turbulens over implantationsstedet, inducere bleb nethindeløsning (BRD) ved lav IOP, forebygge retina og sclera skader gennem tørhed, og passende positionering af kanin. Vi advarer dog som flere intra-operative komplikationer kan opstå som helst, hindrer succes implantation, fx intra okulære blødninger, anæstesi fading af under vitale skridt såsom implantationen, kollapser af BRD grundet instrument manipulation eller okulær hypotoni, rabbit død på grund af for store doser af anæstesi, lavt blodtryk under lang operation forårsager hypoxisk hjerneskader, eller hypertermi. Alligevel disse komplikationer falde med tiden, da de hurtigt tackles og løses ved at øge oplevelsen af ​​det kirurgiske team. Nogle komplikationer kan reduceres ved at følge et par enkle, men alligevel afgørende skridt. Smøremiddel bør tilføjes hver 5 - 10 minutter for at forhindre hornhinde, sclera og konjunktival skade under operationen, og til at opretholde en klar intraokulære medier, kan som tørret / sorte sclera være en årsag til sårruptur, hvilket igen fører til okulær hypotoni og / eller intraoperativ lækage fra sclerotomies. Heparin bør tilsættes for at forhindre dannelsen af en fibrin film, der gør det særligt subretinal implantation udfordrende og samtidig tilsætning epinephrin til at reducere blødning under heparin 16. For lang heparin / eksponering epinephrin gange (&gt; 1 time) bør undgås for at forhindre corneal Edema af endotel dekompensation 33, hypertensiv krise eller intraoperativ dødsfald. Omhyggelig glasagtige fjernelse bør udføres på instrument (post) port for at undgå retinal og / eller choroidale afdelinger. Intraokulære instrumenter bør peget bageste pol for at undgå linse touch (forårsager iatrogen kataraktdannelse) eller (entry site) beskadigelse af nethinden. En intraokulær side-port infusionskanyle bør anvendes, da den dæmper jetstrøm omkring implantation område, hvilket forhindrer ukontrolleret rivning af retinotomy, og sammenbrud af BRD. BRD induktion i midterlinjen (vertikal akse fra synsnerven) eller tæt ved optiske medullære fibre bør undgås for at forhindre omfattende iatrogene retinaløsninger. Endelig sidst men ikke mindst BRD bør induceres ved lav IOP, at undgå subretinal BSS injektion bruge for store strømningshastigheder som kan føre til en beskadigelse af nethinden (fx., Ved strækning). Mange studier variabler som celle carrier varianter, føtal, voksen eller stamcelletransplantation afledt RPE celle kilder, valg for immunosuppressive osv., kan udforskes 14,26,27,34. Yderligere forbedringer såsom serum-fri RPE dyrkningsmetoder, karakterisering af xenoRPE i subretinal rum, fjernelse af værten RPE lag 14 eller strategier for implantat forankring er aktuelle igangværende arbejde. Til dato de beskrevne teknikker er blevet anvendt på 5 forskellige kanin stammer, herunder chinchilla skiderik, Chinchilla skiderik / KBL hybrider, New Zealand Hvid / Røde Kors, New Zealand White (albino) og hollandske fastspændt. Både mandlige og kvindelige kaniner blev opereret, med kaniner mindst 1,5 kg eller 2 måneder (afhængig af arter). De fleste operationer var på pigmenterede kaniner (chinchilla Bastard eller chinchilla Bastard hybrider) med vægte mellem 2,5-3 kg. Alle de kanin stammer vi har haft mulighed for at arbejde med synes at have nogle særheder. I betragtning af exclusive tilgængeligheden af ​​pigmenterede kaniner af chinchilla svin stammen i Tyskland i 2009-13, har vi samlet den største erfaring med disse dyr. Det er desværre ikke længere tilgængelig, da avl er udgået, men sammenligner meget godt til New Zealand Hvid / Røde Kors med undtagelse af mere fordelagtige tykkere sclera og større øje mængder i sidstnævnte. Chinchilla Bastard hybrider har betydelig intraoperativ fibrindannelse og kræver heparin / adrenalin brug som beskrevet ovenfor for at sikre en vellykket subretinal manøvrer. Denne protokol er også foretaget i ikke-pigmenterede albino kaniner (New Zealand White), men særligt BRD skabelse og subretinal implantation er mere udfordrende givet reduceret kontrast påskønnelse. Muligheden for at fremkalde en posterior glaslegemeløsning synes ikke kanin stammen afhængig i vores hænder. Transvitreal subretinal levering er sandsynligvis den fremtidige kirurgiske strategi valg givet det er den mest comm<html> på ruten i dag klinisk til at få adgang til nethinden. Som et resultat mange andre grupper har fremlagt sådanne teknikker for dyrkede RPE på luftfartsselskab støtter dyr arbejde 11,15,23,35. Aramant et al. 36 har et instrument, som placerer stedet skubber deres hydrogel-indkapslet bløde implantat til sin subretinal målsted. Udformningen af Thumann et al. Anvender en hul spatel, som frigiver carrier-støttet graft ved flydende det ud gennem flydende injektion 19. Begge tidligere strategier kræver subretinal indsættelse af instrumentet, som efter vores opfattelse er mere tilbøjelige til komplikationer, når der sammenlignes med et epiretinally appositioned instrument. Montezuma et al. 22 beskrev en subretinal inserter instrument til levering af subretinal chip implantater hos svin, men ingen yderligere arbejde er blevet offentliggjort siden til vores bedste viden. Vi har været i stand til at udvide den beskrevne teknik med nogle ændringer til svin. jove_content &quot;&gt; Vores foretrukne celle bærere er 10 mikron terephthalat tyk polyester (PET) membraner. Fra et kirurgisk synspunkt, dette materiale har gunstige stivhed og elasticitet parametre, foruden sin brede alsidighed under celledyrkningsforsøg. Vi fandt lignende erfaringer med udvidet tetrafluorethylen (ePTFE) 37 eller nanofiber membraner elektrospindes fra PET, poly-mælke / capronolactic syre (PLCL) eller poly -. mælke-co-glycolsyre (PLGA), samt komposit nanofiber (PLGA eller PET) og ultratynd PET 26 Når PET-membraner anvendes med vores metallisk shooter instrument, de har en lejlighedsvis tendens til at udstille elektrostatisk ladning, som udfordrer deres udslyngning fra skytten 27. Ultratynde polyimid membraner kunne i vores hænder ikke implanteret i subretinarummet med protokollen skitseret ovenfor ( manuskript under udarbejdelse). Marmor et al. har systematisk undersøgt spontan resorption af subretinal væske i iatrogene lokaliserede retinaløsninger 38-41. Selv efter manipulation i subretinarummet disse blev anset for at være reabsorberes af postoperative dag 4 i begivenhedsløs operationer. Laser retinopexi udføres ikke at sikre kanterne af retinotomy. Selvom ulogisk sammenlignet med human kirurgi bliver luft / gas tamponade ikke påkrævet. Medmindre der kan opnås omhyggelig fjernelse af perifert glaslegemet, især i superior kvadrant, dette kan faktisk resultere i gigantiske retinale tårer oprindelse fra retinotomy site. Det anbefales kun at udføre flydende luftskifte med efterfølgende 20% SF6 gas tamponade at redde intraoperative iatrogene retinaløsninger eller hvis en bestemt implantat position skal sikres. Selvom den mekanisk induceret ablation af den neurale retina kan forårsage RPE og fotoreceptor skader i kaniner 42,43, dens omfang varierer meget (selv med regelmæssige BSS) deafventning af faktorer som IOP, sprøjte typer, der benyttes, injektionsvolumen med derved induceret retinal strækning osv. Vi har også testet den ofte anbefales Ca / Mg-free BSS lettet løsrivelse 42-44, men fandt, at det forårsager intraoperativ linseuklarhed (især med forhøjet temperatur), og signifikant forsinker eller endda svækker retinal re-fastgørelse 27. Langsom subretinal injektion af 20 - 30 ul volumen af ​​regelmæssig BSS med en 100 pi sprøjte anbefales derfor; injektionsnål bevægelser bør være minimal, så retinotomy sæler omkring det og forhindre Bruchs skader membran. Noget af iatrogen skade kan løses ved RPE sårheling og den fundne relative bevaring af ONL tykkelsen efter refiksation, antyder, at RPE / fotoreceptor-komplekset kan tolerere denne forringelse, som også beskrevet af andre 45. Cell-baserede lægemidler eller retinale proteser kræver prækliniske animal test forud for myndighedsgodkendelse og begyndende menneskelige sikkerhedsundersøgelser. Den tidligere varierer fra land til land. Kaninen model her beskrevne kan tjene som en omkostningseffektiv og mindre udfordrende platform til oprettelse eller endda udføre alle krav fra myndighederne. Desuden kan det efterfølgende virke til træning af kirurger i eventuelle multicenter kliniske forsøg eller yderligere forbedringer af teknikken undervejs.

Alder maculadegeneration (AMD) er den mest almindelige årsag til synshandicap hos voksne i alderen 50 eller ældre i industrielt udviklede lande, da det medfører tab af det centrale syn. Ca. 15% af disse patienter lider af den &quot;våde&quot; form af sygdommen, hvor neovaskularisering stammer fra årehinden og forstyrrer retinal funktion 1. Denne variant kan behandles med en yderst effektiv terapi med gentagne intra-vitreum- injektioner af anti-angiogeniske lægemidler 2. Men det store flertal af patienter (~ 85%) lider, fra tør form, som er karakteriseret ved ekstracellulære aflejringer (f.eks drusen) under det retinale pigment epitel (RPE). Disse aflejringer forårsager RPE dysfunktion fører til retinal atrofi i macula. I mangel af nogen helbredende behandlingsmuligheder, AMD udviklet sig til en intensivt udvikler forskningsområdet, hvor mange forskellige helbredende terapeutiske metoder er ved at blive testet. Kirurgisk RPE udskiftning eren attraktiv fremtid mulighed for at besejre denne invaliderende sygdom 3. Autolog subretinal RPE transplantation erstatter dysfunktionel eller tabt RPE i macula, og har potentiale til at genoprette sin fysiologiske funktion 4-9. Denne kirurgisk teknik havde et gennembrud med udviklingen af RPE differentiering protokoller fra menneskelige embryonale stamceller (hESC) og inducerede pluripotente stamceller (IPSC), hvilket giver forskeren en ubegrænset celle kilde til RPE til transplantation 10. RPE transplantation er nu anerkendt som en attraktiv first-in-menneskelige ansøgning om stamceller afledte lægemidler. Øjet tilbyder fremragende kirurgisk adgang og sofistikeret in vivo overvågningsværktøjer 11-13. For at omplante RPE, en måde er med en minimalt invasiv levering ved hjælp af en celle suspension alternativt, for bedre at bevare RPE egenskaber og transplantation funktion, kunstig luftfartsselskab substrAtes (stillads) for RPE udskiftning overvejes 4,14,15. Store dyremodeller er nødvendige for præklinisk validering, men detaljerede tekniske oplysninger om håndtering af dyr og kirurgisk teknik mangler til dato 16-23. Vi og andre 11,24 trods visse tegn på det modsatte 25, foreslår anvendelsen af en stiv, men alligevel elastisk bæresubstrat, da det giver en mere sikker håndtering, bevarer monolag integritet og funktionalitet. Over tid har vi testet flere specialdesignede instrumenter og tilhørende teknikker til implantering af celle-carrier understøttede RPE transplantationer ind subretinarummet (SRS). Vi udnyttede intraoperative videooptagelser, in vivo scanning laser oftalmoskopi kombineret med spektral domæne optisk kohærens tomografi (SLO / SD-OLT) og histologi at evaluere implantation succes 14,26,27. Her giver vi vort nuværende anbefaling for subretinal RPE implantater i kaniner,som blev testet i 5 forskellige kanin-stammer, 7 celle bærermaterialer og 4 RPE cellekilder i over 150 procedurer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>s30 ultrasonic cleaning unit</td>
			<td>Elmasonic</td>
			<td>100 4631</td>
			<td>2.75L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DE-23&#160; autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>C 2209</td>
			<td>23L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>300013 
			300995&#160; 
			301285 
			300294 
			300330&#160;</td>
			<td>1ml x3 
			2ml x3 
			5ml x1 
			10ml x1 
			20ml x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196 
			305136</td>
			<td>18G x 1&#160; 
			27G x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#20</td>
			<td>blade#20 x3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>HARTMANN 
			LOHMANN &#38; RAUSCHER</td>
			<td>277 502 
			25 440</td>
			<td>60x40 cm x2 
			12x17 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular sticks</td>
			<td>LOHMANN &#38; RAUSCHER</td>
			<td>16 516</td>
			<td>66x5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister gauze sponges</td>
			<td>HARTMANN</td>
			<td>481 274</td>
			<td>x2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closure strips</td>
			<td>HARTMANN</td>
			<td>540 686</td>
			<td>x4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opmi Visu CS Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/a</td>
			<td>incl. fundus imaging system BIOM II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chandelier endoillumination</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-S03503 + 
			G-S03504</td>
			<td>25G incl. trocar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light machine</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-26033</td>
			<td>Xenotron III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrectomy machine</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-60000</td>
			<td>MegaTRON S4 S4/ HPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrector</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-46301</td>
			<td>MACH2 vitreous cutter 23G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venturi cassette&#160;</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-60700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sideport-infusion cannula</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>custom&#160;</td>
			<td>1x23G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk suture</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>V546G</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-19135</td>
			<td>x2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-19777</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sclerotomie blade</td>
			<td>Ziemer</td>
			<td>21-2301</td>
			<td>1x23G 
			1x20G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 silk suture</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>EH6162H</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-32320</td>
			<td>x2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris forceps</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-18910</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-18950</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extendible subretinal injection needle</td>
			<td>DORC</td>
			<td>1270.EXT</td>
			<td>41G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VR scissor</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-36542</td>
			<td>25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grieshaber forceps holder</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>712.00.41</td>
			<td>23G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissor forceps tips</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>723.52</td>
			<td>23G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Implant loading station</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt oval implant trephine&#160;</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>custom-made&#160;</td>
			<td>2.4 x 1.1 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shooter dummy</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-32227</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shooter</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-S03443</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flute needle</td>
			<td>DORC</td>
			<td>1281.SD</td>
			<td>20G (Vacuum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>24535</td>
			<td>100&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>&#160;664160</td>
			<td>100 x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectralis Multi-Modality 
			Imaging System</td>
			<td>Heidelberg 
			Engineering</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Spectralis HRA 
			&#160;+ OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs and solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Active agent</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucadont-IS</td>
			<td>Merz Hygiene</td>
			<td>virucidal instrument disinfectant&#160;</td>
			<td>2L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucocit&#160;T</td>
			<td>Merz Hygiene</td>
			<td>Aldehyde-free instrument disinfectant</td>
			<td>2L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin 10%</td>
			<td>WDT</td>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>10ml (100mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Domitor</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>Medetomidine hydrochloride</td>
			<td>10ml (1mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>10ml (5mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neosynephrin POS 10%</td>
			<td>URSAPHARM</td>
			<td>Phenylephrine HCl</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mydriacyl</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tropicamid</td>
			<td>10ml (5mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methocel 2%</td>
			<td>Omni Vision</td>
			<td>hydroxypropyl methylcellulose</td>
			<td>10g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURI CLEAR</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Balance salt solution (BSS)&#160;</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose 5%&#160;&#160;</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>Glucose 5%&#160; solution</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Natrium-25 000</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>Heparin</td>
			<td>5ml (2500 unit/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprarenin</td>
			<td>SANOFI</td>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>1ml (1mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triamcinolone</td>
			<td>University of Bonn pharmacy</td>
			<td>preservative-free Triamcinolone&#160;</td>
			<td>1ml (40mg/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoptomax eye ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>dexamethasone 1 mg/g 
			neomycin sulfate 3,500 IU/g 
			polymyxin B sulfate 6,000 IU/g</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Povidon-Iod</td>
			<td>30ml (1g/10ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optive</td>
			<td>ALLERGAN</td>
			<td>sodium carboxymethylcellulose glycerol</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step by step protocol for subretinal surgery in rabbits

Alder maculadegeneration (AMD), retinitis pigmentosa, og andre RPE sygdomme er de mest almindelige årsager til uoprettelige tab af synet hos voksne i industrielt udviklede lande. RPE transplantation synes at være en lovende terapi, da det kan erstatte dysfunktionelle RPE, genoprette sin funktion, og dermed vision. Her beskriver vi en fremgangsmåde til omplantning en dyrket RPE monolag på et stillads i subretinarummet (SRS) af kaniner. Efter vitrektomi xenotransplantater blev leveret i SRS anvendelse af en skræddersyet shooter bestående af en 20-gauge metallisk dyse med en polytetrafluorethylen (PTFE) belagt stemplet. Den nuværende teknik udviklet sig i over 150 kanin operationer over 6 år. Postoperativ opfølgning kan opnås under anvendelse af ikke-invasiv og gentagne in vivo-billeddannelse, såsom spektral domæne optisk kohærens tomografi (SD-OLT), efterfulgt af perfusion-fikseret histologi. the metode har veldefinerede trin for let læring og høj succesrate. Kaniner betragtes som en stor øje dyremodel nyttig i prækliniske studier til klinisk oversættelse. I denne sammenhæng kaniner er en omkostningseffektiv og måske praktisk alternativ til andre store øjne dyremodeller.

Resultaterne fra den beskrevne fremgangsmåde til subretinal implantation er vist i tabel 2. Anslag af transplantatet under nethinden havde en succesrate på ca. 61%, når en kernevitrektomi blev udført og steg op til 76%, når posterior glaslegemeløsning blev induceret. Disse tal omfatter ca. 21% af dyrene, der døde enten intraoperativt eller i de første 3 dage efter operationen. Denne teknik kan bruges til at implantere to stilladser på forskellige retinale områder på det ene øje samtidigt. Kaninerne undergik postoperativ in vivo følge op ved hjælp SD-OLT histologisk behandling som beskrevet af Stanzel et al. 27 (figur 2). Fig. 2A viser scanning laser oftalmoskop infrarød reflektans foto af implanterede dyrket RPE på en polyester membran (PET) efter ukompliceret transplantation. Dethalo omkring implantatet svarer til fotoreceptor atrofi. Fig. 2B viser tilsvarende SD-OLT varsel retinal, hovedsageligt ydre nukleare lag (ONL) udtynding, hyper reflekterende bånd på SD OLT over implantat, mens den neurale nethinde ved siden af implantatet viser nær-normal refleksion bands. Disse resultater antyder en atraumatisk levering. Fig. 2C viser Hematoxiline / eosin (H / E) plet af implantatet, som viser subretinal ardannelse og ONL atrofi omkring retinotomy stedet sandsynligvis som et resultat af iatrogen manipulation, en sammenhængende endnu uregelmæssig pigmenteret lag over PET. Bruchs membran under implantatet syntes også at være sammenhængende, og choriocapillaris indeholder nogle spredte erythrocytter. Disse morfologiske resultat kan sammenlignes med SD-OLT styrke tesen om en atraumatisk levering. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/53927/53927fig1.jpg" /> fig<html> ure 1: Loading Shooter med human iPSC-RPE dyrket på PET Cell Carrier. A) viser udstanse et implantat hjælp specialfremstillede nål. B) Bean-formet implantat skåret fra cellekultur. C) Placering af implantatet før ilægning. D) Loading af skydespil med implantat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal .</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53927/53927fig2.jpg" /> Figur 2: dyrkede humane hES-RPE på PET Cell Carrier 4 uger i Rabbit subretinarummet. A) Viser SLO infrarød reflektans billede, den grønne linje afgrænser tværsnittet vist i fig. 2B. B) Tilsvarende SD OLT. C) H / E plet, se tekst eller 26,27 for detaljer.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:97px;"> Parameter </td><td style="width:131px;"> brugte indstillinger </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> vitrectomy </td><td> 6.000 snit / min </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Vakuum </td><td> 200 mmHg </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rise tid </td><td> 1 sek </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Luft </td><td> 24 mmHg </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Vanding </td><td> 24 CMH 2 O </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Diathermy </td><td> 30% </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Parameter Setup af Vitrektomi Machine. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> vitrectomy </td><td> Implant </td><td> Kaniner drives </td><td> vellykket implantat </td><td> Mislykket implantat </td><td> Død </td><td> Succesrate% </td></tr><tr><td> kernevitrektomi </td><td> KÆLEDYR </td><td> 30 </td><td> 19 </td><td> 4 </td><td> 7 </td><td> 63,33 </td></tr><tr><td></td><td> PET + RPE </td><td> 70 </td><td> 42 </td><td> 12 </td><td> 16 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> PVD, ± plasmin m / PPV </td><td> KÆLEDYR </td><td> 28 </td><td> 21 </td><td> 2 </td><td> 5 </td><td> 75 </td></tr><tr><td></td><td> PET + RPE </td><td> 22 </td><td> 17 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 77,27 </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Oversigt over de sidste 150 operationer, herunder Metode og Implant Type.

Watch this Scientific Journal Video about A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits at JoVE.com

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Retinal pigment epitel (RPE) udskiftning strategier og gen-baseret behandling er i betragtning til flere retinale degenerative tilstande. For klinisk oversættelse, er store øjne dyremodeller der kræves for at studere kirurgiske teknikker, der gælder i patienter. Her præsenteres en kaninmodel for subretinal kirurgi rettet mod RPE transplantation, der er alsidig og omkostningseffektiv.

En trin for trin Protokol for subretinal kirurgi i kaniner

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Detektion og Genogrouping af norovira fra børne Taburetter Ved Taqman Et-trins RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Sådan måler du Kortikal Folding fra MR-billeder: en trin-for-trin introduktion til at beregne Lokal Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

Måling Frailty i HIV-smittede personer. Identifikation af svagelige patienter er det første skridt til forbedring og Tilbageførsel af Frailty

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Nethindeløsning Model i Gnavere ved subretinal Injektion af Natriumhyaluronats

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Udførelse subretinale Injektioner i Gnavere at levere retinale pigmentepitel celler i suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Step By Step: Microsurgical training method combining two nonliving animal models

Trin for trin: Microsurgical træningsmetode kombinerer to ikke levende dyremodeller

The learning of microsurgical techniques and the maintenance of microsurgical skills have been traditionally based on the use of living animals, mainly ...

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

Heterotop Renal autotransplantation i en Porcine Model: En trin-for-trin-protokollen

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality ...

Discovering Middle Ear Anatomy by Transcanal Endoscopic Ear Surgery: A Dissection Manual

At opdage mellemøret anatomi af Transcanal endoskopisk øre kirurgi: en dissektion Manual

The middle ear is located in the center of the temporal bone and bears a highly complex anatomy. The recently introduced exclusively endoscopic transcanal ...

Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat

Tager det næste skridt: en neurale coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model at maksimere funktionel helbredelse i Rat

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Brug af en kemisk biopsi til graft kvalitetsvurdering

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...