Name: a step by step protocol for subretinal surgery in rabbits
Uploaded: 2016-09-13T12:30:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits at JoVE.com

Med stöd av Rüdiger Foundation under 2008 och 2010 (BVS), BONFOR / Gerok stipendium O-137,0015 (BVS), BONFOR / Gerok stipendium O-137,0019 (FT), Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, kinesiska stipendium rådet nr 2008627116 (ZL) och en obegränsad bidrag från Geuder AG, Heidelberg (Fig. 2). Medlemmar av H. Skottman laboratorium, Tammerfors universitet Finland tacksamma för att ge hES härledda RPE visas i figur 2.

Etik av djurhantering i ögon forskning: Vi fått godkännande från den etiska kommittén vid medicinska fakulteten vid universitetet i Bonn, och följa de riktlinjer som anges av Föreningen för forskning i Vision och oftalmologi (ARVO). Dessutom har alla förfaranden som godkänts av de statliga tillsynsmyndigheterna i Nordrhein-Westfalen. Djuren hålls inomhus i en specialiserad anläggning i ett luftkonditionerat rum med temperaturer mellan 18-20 ° C, exponering för vanlig dagsljus, i standardiserade individuella burar med fri tillgång till mat och vatten. Obs: För att säkerställa att djuren operativa affinitet, är ett djurhälsan poängark följt som innehåller följande slutgiltiga djuruteslutningskriterier: 20% viktminskning jämfört med vikt vid införsel; uppenbara cyanos av djuret; djur rysningar, har kramper eller inte kan röra sig i samordning; . ataxi / parestesier, t.ex. förlamar; apati; extrem auto stympning (hudsår, avhuggna lemmar). &lt;/ P&gt; 1. Instrument Sterilization <ol><li> Placera återanvändbara instrument i ultraljudsbad. </li><li> 500 ml destillerat vatten och 2 ml instrument desinfektionsmedel. </li><li> Rena instrument använder svepfunktion för 15 minuter. </li><li> Ta bort instrument från ultraljudsbad och skölj noggrant med destillerat vatten i 5 minuter. </li><li> Sätt instrument i autoklav och använda standardprogrammet (sterilisering av instrument enligt 121 ° C i 20 min). </li></ol> 2. Instrument Förberedelse <ol><li> Upprätta och upprätthålla ett sterilt område, genom att arbeta i ett stängt rum, klädd kirurgiska skurar, mask och hår lock. Desinficera händerna innan bära sterila operationshandskar. För detaljerad strategi se 28. </li><li> Placera steriliserade instrument på en steril duk. </li><li> Placera en ml spruta fylld med 40 mg triamcinolon fäst till en 27 G nål för injektion, 10 ml spruta med balanserad saltlösning (BSS), och 5 ml spruta of smörjmedel på duken. </li><li> Placera 3-0 silke, 7-0 vicryl, okulära pinnar (för att stoppa konjunktival / skleral blödning), twister gasväv svampar, lindade förslutningsremsor (att fixera vitrektomi spets slangen), och ljuskrona endoillumination fibertråd på en duk. </li><li> Packa upp 25 G ljuskrona endoilluminator och ansluta till ljus maskin med sterila tekniker (se steg 2,1). Anslut vitrektomi set med hög hastighet vitrector och Venturi kassetten vitrektomi maskinen med steriltekniker (se steg 2,1). </li><li> Öppna 500 ml BSS flaska och anslut lösning till Venturi kassett enligt tillverkarens anvisningar. </li></ol> 3. Beredning av Anestesi och positionering av djur <ol><li> Väg djur för att säkerställa korrekt medicinering dosering. </li><li> Förbered intramuskulär (IM) anestesi med hjälp av en spruta med 27 G nål innehållande 0,35 mg / kg ketamin och 0,25 mg / kg medetomidin för start. Vänd sprutan för att blanda. </li><li> Förbered 2 sprutor med 1/3 than doser för att upprätthålla anestesi under operationen. </li><li> Förbered spruta innehållande 20 ml av 5% glukoslösning och 18 G nål för subkutan injektion som en intravenös infusion alternativ. </li><li> Ge 3 x 1 droppe mydriatiska ögondroppar före vitrektomi för elev dilatation. </li><li> Cover kanin med filt att lugna före anestesi injektion, injicera i bakbenet (sätesmuskeln) och massage runt injektionsstället i 30 sekunder. Obs: Det första skottet av IM anestesi varar ca 1-2 timmar. beroende på kaninens storlek, läkemedelstolerans, fettlager, stress och kroppstemperatur. Det första tecknet på anestesi bleknar bort är en nystagmus (måste övervakas av kirurgen), efterföljande injektioner senaste ca 30 - 45 min. </li><li> Bekräfta korrekt anestesi, genom att kontrollera hypnos, hyporeflexi, smärtlindring och muskelavslappning av djuret. </li><li> Ge subkutan injektion (Pt. 3.3) i nacke hudveck, när kaninen är medvetslös. </li><li> Lägg metylCellulose smörjmedel varje 5-10 min i opererade ögat, tillsätt smörjmedel och band lock i icke-opererade ögat. </li><li> Placera den täckta kanin på operationsbordet draperad med ett lock såsom en bomullsfilt i en optimal position (näsa något förhöjd genom en form av filt, så det är i nivå med ögonytan) under operationsmikroskop. Rikta ögat vinkelrät mot mikroskopobjektiv. </li><li> Säkerställa korrekt kroppstemperaturen med hjälp av rektal termometer (normotermi 39 ± 1 ° C) 29. </li><li> Cut ögonfransar med sax (vissa salva på bladet) för att minska postoperativa infektioner. </li><li> Desinficera ögat med användning av 2 - 3 droppar av 0,1 g / ml povidonjod topiskt under 1 min och skölj med sterilt BSS. </li><li> Täck ögonen med steril duk med färdigskurna öppning i mitten för ögat och sedan täcka med (klibbig) kirurgiska ingreppet drapera 12 x 17 cm. </li></ol> 4. vitrektomi <ol><li> Proptose och säker ögat med 3-0 siden med inverted tjocklek och utför en konjunktival peritomy. <ol><li> Incisionsfilm bindhinnan med en Vannas sax nära limbus men tillräckligt långt från blodkärlen (~ 1 mm avstånd). </li><li> Dissekera bindhinnan genom att skapa en &quot;T-cut&quot;. Först förstora peritomy med sax parallellt med limbus och sedan incisionsfilm bindhinnan vertikalt i form av ett &quot;T&quot; i ca 6 - 7 mm. Separera försiktigt bind rakt på sak. </li></ol></li><li> Gör en sclerotomy med hjälp av en 23 G microvitreoretinal (MVR) blad klockan 8 på höger öga / OD (klockan 4 på vänster öga / OS) genom att försiktigt föra in den vassa spetsen av bladet i riktning mot synnerven. Sakta dra bladet i samma riktning och undvika att utvidga sclerotomy. </li><li> Sätt och sutur anpassade sidoport-infusionskanyl 27 med hjälp av 7-0 siden sutur och ställa det intraokulära trycket (IOP) vid 24 mmHg. </li><li> Utför en sclerotomy med 25 G platt huvud trokar klockan två på OD (10 o &#39;; Klocka på OS) som liknar steg 4,2. </li><li> Sätt 25 G ljuskrona ljus i platt huvud trokar, fixera med tejp och slå på ljuskälla vid ca 30%. </li><li> Om det behövs, ta bort ödematös hornhinnans epitel med hjälp av en # 20 skalpell för bättre intraokulära visualisering. </li><li> Utför en sclerotomy liknande steg 4,2 klockan 10 på OD (02:00 på OS), (för) plats u-formade 7-0 suturer runt sclerotomy utan att binda knuten och sätt vitrektomi skärspetsen. </li><li> Börja vitrectomy 30 runt ingångsöppningen, sedan fortsätta under den optiska skivan och fibrae medullares med höghastighets vitrector genom att skära glaskroppen i små bitar på max. 2000 - 3000 skär / min, uppsugande vid max. 200 mmHg som använder den angivna parametern installationen av vitrektomi maskinen (tabell 1) </li><li> Utför en glaskroppsavlossning (PVD) genom att separera glaskroppen från näthinnan genom att hålla hög hastighet vitrector över den bakre stolpen ennd (om möjligt försiktigt) överlägsen på skivan 31 medan aspire endast vid max. 200 mmHg utan att skära. </li><li> Injicera ca 50 | j, l (20 mg) triamcinolon eller utspädda fluorescein (ca 0,1 mg / ml) intravitrealt för att visualisera och underlätta (nära totalt) avlägsnande av den flytande glaskroppen över den bakre polen och midperiphery under vitrektomi. Undvik att korsa över under objektivet. Indrag raka perifera glaskroppen av en (utbildad) assistent rekommenderas om gas tamponad önskas. </li><li> Tillsätt 20 enheter / ml heparin och 0,5 mg adrenalin till en slutlig koncentration av 0,001 mg / ml i BSS infusionslösning parallellt eller efter steg 4,10. Obs: Som heparin / adrenalin inte injiceras intraokulära deras effekter försenas beroende på infusionsflödeshastighet. </li></ol> 5. Loading Shooter Obs: Det arbete som beskrivs häri inte faller under principerna i Helsingforsdeklarationen, det inte innebära humana patienter. Här, standard RPE-celler isolerades från foster mänskliga ögon, odlade och differentierade på obestruket 10-im tjock polyester (PET) skär enligt vår tidigare publicerade protokoll 14. Ett tillstånd att arbeta med den mänskliga foster material erhölls från den etiska kommittén vid universitetet i Bonn. Alternativt var hES-RPE levereras från Skottman lab (manuskript under prep.), Där de odlades i enlighet med den teknik som beskrivits av Vaajasaari et al 32.; för dessa celler ett tillstånd har erhållits från R. Koch-institutet i Berlin, Tyskland. <ol><li> Skölj cellodling innan förberedelse av implantat 3x med ögon klass BSS. </li><li> Fyll en standard cellodlingsskål (100 x 20 mm) med 10 ml ögon klass BSS. </li><li> Lägga cellodlings insatsen i BSS och centrera skålen under ett ljusmikroskop. </li><li> Stansa ut en 2,4 x 1,1 mm implantat med en trubbig, oval, skräddarsydd nål för att få en platt, böna formade substratmed två långsidor och två runda kanter. </li><li> Svämma försiktigt nålen genom den andra porten med BSS att spola ut implantatet i BSS fylldes skräddarsydda laddningsstation (Figur 1). </li><li> Eventuellt skära en rund ände av implantat (&lt;0,5 mm), bara för att få en tredje kant. </li><li> Se till att implantatet är i rätt orientering genom att säkerställa att monoskiktet ligger upp på cellbäraren. För att ändra positionering försiktigt använda två skalpeller. </li><li> Pressa implantatet försiktigt och fullständigt in i skytten instrument med användning av nålhållaren till dess att allt av implantatet är fäst på insidan av spetsen. Kolven bör förbli indragen. </li><li> Håll &quot;laddade&quot; shooter spets i laddningsstationen enligt BSS ända till implantation. </li></ol> 6. Implantation <ol><li> Närma neurala näthinnan med utdragbar 41 G subretinal injektionsnål ansluten till en gastät spruta (se till att alla luftbubblor har evakueratsfrån slangen!). </li><li> Injicera BSS (med kalcium och magnesium / CM) subretinally och därmed skapa en Bleb näthinneavlossning (BRD) av ca 2-3 skivdiameter (DD). Två BRD per öga kan höjas på ett säkert sätt. </li><li> Förstora retinotomy till 1,5 mm med vertikala 23 G VR-sax. Subretinal utrymmet är nu tillgänglig för implantation eller ytterligare manövrering. </li><li> Förläng sclerotomy (exakt) med en 1,4 mm snitt kniv till 20 G strategi. </li><li> Försök passerar genom sclerotomy med hjälp av en 20 G shooter dummy, förstora som behövs för att säkerställa en smidig, men ändå tätt övergång av den laddade skytten. </li><li> Väl den laddade skytten 27 genom sclerotomy helst vid 24 mmHg. </li><li> Tillvägagångssätt retinotomy kant och mata ut implantatet subretinally från en Epiretinal läge. </li><li> Justera implantatet med halvslutna 23 G sax, pincett eller 41 G nål för att se till att den är placerad väl under retina- rimligen bort från retinotomy. </li></ol> 7.slutar Operation <ol><li> Ta bort 25 G ljuskrona och infusionskanyl. </li><li> Sutur alla sclerotomies. </li><li> Injicera 25 | al (10 mg) triamcinolon av klockan 8 sclerotomy (före suturering sista sclerotomy). </li><li> Kontrollera / justera IOP genom palpation och injicera BSS via 30 G nål / spruta, om det behövs. </li><li> Sutur konjunktiva med 7-0 vicryl. </li><li> Ta bort proptosing 3-0 siden sling långsamt (Undvik djup orbital venös plexus!). </li><li> Lägg dexametason / antibiotisk salva under locket. </li><li> Läge under 1 h täckt med filt med opererade ögat vänd uppåt (w / o gas), eller nedåt (med luft / gas). </li><li> Lämna inte djur utan uppsikt tills det återfår tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala bakåtlutad kroppsställning. </li><li> Transportera inte kanin före anestesi bleknar helt kan detta påskyndas genom att injicera medetomidin upphävande medlet är lika med mängden medetomidin ges. </li></ol> 8. Postoperativ Djurvård <ol><li> Ha kvarkaniner under lämpliga förhållanden (temperatur, ljus, mat, vatten, utrymme, osv.) och noggrann övervakning vid en specialistklinik. </li><li> Se till att djuret är utvilad, dvs. Inga långa perioder av mat eller vatten förlust. </li><li> Leta efter några sår eller skador, särskilt på injektionsställen. </li><li> Håll sår torrt för att förhindra infektioner. Ge antibiotika vid misstanke infektion: dexametason 1 mg / g, neomycinsulfat 3500 IU / g, polymyxin B-sulfat 6000 IU / g salva applicerades två gånger dagligen under en vecka efter operationen på den okulära ytan. </li><li> Lägg dexametason / antibiotisk salva för nästa 7 dagar efter operationen två gånger dagligen för bättre okulär yta förnyelse och minskad postoperativ smärta. </li><li> Ge systemiska analgetika (Carprofene 4 mg / kg två gånger dagligen) för initial 48 h. </li><li> Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala bakåtlutad kroppsställning. </li><li> Skicka inte tillbaka ett djur somhar opererats för sällskap med andra djur tills återhämtat sig helt. </li><li> Utsätt inte djur för onödigt lidande. </li></ol> 9. SLO / SD-oktober Vägledning <ol><li> Förbered och injicera intramuskulärt (IM) anestesi med hjälp av en spruta med 27 G nål innehållande 0,175 mg / kg ketamin och 0,125 mg / kg medetomidin för start. Vänd sprutan för att blanda. </li><li> Lägg ett smörjmedel åtminstone var 5 minuter för att återfukta ögonen och upprätthålla tydliga SD-oktober avbildning, eventuellt en anpassad kontaktlins kan användas. </li><li> Bifoga en stålplattform till nackstödet att stabilisera djuret i önskat läge. </li><li> Placera kanin på stål plattform, placera sitt öga vinkelrät mot sond. </li><li> Håll kaninens huvud från den nedre kindbenet (mandibula) undvikande av luftstrupen. </li><li> Tilt djurets huvud med ungefär 45 ° mot SD-oktober sond för att optimera betraktningsvinkel på implantatet. </li><li> Använd en 30-graders objektiv och följande parametrar för optimal oktober imaging [HS]: 30 grader inställningar för enda rad skannar med ART inställt på 100 (utjämning) och 20 x 20 graders inställningar för volymskanningar med ART inställt på 15; hög upplösning är inte nödvändig. </li><li> Använd SLO infraröd reflektans avbildning för att hitta fokalplanet av implantatet (Figur 2A.); optimal fokus uppnås när (alla) implantat kanterna är skarpa 14. </li><li> Lägg dexametason 1 mg / g, neomycinsulfat 3500 IU / g, polymyxin B-sulfat 6000 IU / g salva under locket när du är klar. </li></ol>

RB, BVS, ZL, NE och Geuder AG har lämnat in en europeisk patentansökan på skytten. NB är anställd hos Geuder AG. Publiceringsersättningar för video-artikeln betalades av Geuder AG.

Med hjälp av en kaninmodell, är en säker och reproducerbar metod presenteras för transvitreal leverans av odlade RPE på cellbärare i subretinal rymden med ett skräddarsytt shooter instrument. Den beskrivna metoden ger en kort / optimerad kirurgisk teknik för enkel inlärning, eftersom det innebär standardtekniker i vitrektomi med subretinal manövrar. Resultatet är i hög grad underlättas av en ren vitreoretinala gränssnitt, och det intraokulära infusion som undviker turbulens över implantationsstället, förmå Bleb näthinneavlossning (BRD) vid låg IOP, förebygga näthinnan och sklera skada genom torrhet, och lämplig placering av kaninen. Vi försiktighet emellertid, eftersom flera intra operativa komplikationer kan inträffa när som helst, vilket hindrar en framgångsrik implantation, t ex intra okulära blödningar, anestesi blekning av under viktiga steg, såsom implantation, kollapsar i Brd grund av instrumentmanipulation eller okulär hypotoni, rabbit dödsfall på grund av höga doser av anestesi, lågt blodtryck under lång drift orsakar hypoxisk hjärnskada, eller hypertermi. Men dessa komplikationer minskar med tiden eftersom de snabbt åtgärdas och lösas genom att öka upplevelsen av kirurgerna. Vissa komplikationer kan minskas genom att följa några enkla, men viktiga steg. Smörjmedel bör till varje 5-10 minuter för att förhindra hornhinnan, skleral och konjunktival skada under operationen, och för att upprätthålla en tydlig intraokulära medier kan som torkas / svärtade senhinnan vara en orsak till sårruptur, vilket i sin tur leder till okulär hypotoni och / eller intraoperativ läckage från sclerotomies. Heparin bör sättas för att förhindra bildningen av en fibrin film som gör särskilt subretinal implantation utmanande och samtidig tillsättning epinefrin för att minska blödning under heparin 16. För lång heparin / epinefrin exponeringstider (&gt; 1 timme) bör undvikas för att förhindra hornhinnan edema av endotel dekompensation 33, hypertensiv kris eller intraoperativ dödsfall. Noggrann glasartad avlägsnande bör genomföras i hamnen instrument (post) för att undvika retinal och / eller koroidala avdelningar. Intraokulära instrument bör vara riktad mot bakre stolpen för att undvika lins touch (orsakar iatrogen kataraktbildning) eller (entry site) skada på näthinnan. En intraokulär sidoport infusionskanyl bör användas, eftersom den dämpar jetströmmen runt implantation området, vilket förhindrar okontrollerad sönderrivning av retinotomy, och kollaps av BRD. Brd-induktion i mittlinjen (vertikala axeln från synnerven) eller nära optiska medullär fibrer bör undvikas för att förhindra omfattande iatrogena näthinneavlossning. Slutligen, sist men inte minst BRD bör induceras vid låga IOP, för att undvika subretinal BSS injektion med överdrivna flödeshastigheter som kan leda till en skada på näthinnan (eg., Genom att sträcka). Många studievariabler såsom cell carrier varianter, fetal, vuxen eller stamcells härrör RPE cellkällor, val för immunsuppressiva, etc., kan utforskas 14,26,27,34. Ytterligare förbättringar såsom serumfria RPE odlingsmetoder, karakterisering av xenoRPE i subretinal utrymme, avlägsnande av värd RPE skiktet 14 eller strategier för implantat förankring är aktuella pågående arbete. Hittills de beskrivna tekniker har använts på 5 olika kanin stammar, inklusive chinchilla jävel, Chinchilla jävel / KBL hybrider, Nya Zealand White / Röda Korset, Nya Zealand White (albino) och holländska bältade. Både manliga och kvinnliga kaniner opererades, med kaniner minst 1,5 kg eller 2 månaders ålder (beroende på art). De flesta operationer var på pigmenterade kaniner (chinchilla jävel eller chinchilla jävel hybrider) med vikter mellan 2,5-3 kg. Alla kanin stammar vi har haft möjlighet att arbeta med verkar ha några egenheter. Med tanke på den exkive tillgången på pigmenterade kaniner av chinchilla jäveln stammen i Tyskland 2009-13, har vi samlat mest erfarenhet av dessa djur. Det är tyvärr inte längre tillgänglig, eftersom avel har upphört, men jämför mycket väl till New Zealand White / Röda Korset med undantag för mer fördelaktig tjockare sklera och större ögonvolymer i den senare. Chinchilla jävel hybrider har betydande intraoperativ fibrinbildning och kräver heparin / epinefrin användning som beskrivs ovan för att säkerställa framgångsrika subretinal manövrar. Detta protokoll har också utförts i icke-pigmenterade albinokaniner (New Zealand White), men särskilt BRD skapande och subretinal implantation är mer utmanande med tanke på minskad kontrast uppskattning. Möjligheten att framkalla en glaskroppsavlossning inte verkar kanin stam beroende i våra händer. Transvitreal subretinal leverans är sannolikt den framtida kirurgiska strategiska val eftersom det är den mest comm<html> på väg numera kliniskt för att få tillgång till näthinnan. Som ett resultat av många andra grupper har presenterat sådana metoder för odlade RPE på bäraren stöder djurarbete 11,15,23,35. Aramant et al. 36 har ett instrument, vilket ställer snarare än skjuter deras hydrogel-inkapslad mjuk implantatet sitt subretinal målplats. Utformningen av Thumann et al. Utnyttjar en ihålig spatel, som frisätter bäraren stödda transplantat av flyt bort det genom vätskeinjektion 19. Båda tidigare strategier kräver subretinal införande av instrumentet, som enligt vår mening är mer benägna att komplikationer, jämfört med en epiretinally appositioned instrument. Al. Montezuma et 22 beskrev en subretinal kuverte instrument för leverans av subretinal chip implantat hos grisar, men ingen ytterligare arbete har publicerats sedan det bästa av vår kunskap. Vi har kunnat förlänga den beskrivna tekniken med viss modifikation till gris. jove_content &quot;&gt; Våra föredragna cell bärare är 10 mikrometer tjock polyester (PET) membran. Ur ett kirurgiskt perspektiv, har detta material gynnsamma styvhet och elasticitet parametrar, utöver sitt breda mångsidighet under cellodlingsexperiment. Vi hittade liknande erfarenheter med utökad tetrafluoretylen (ePTFE) 37 eller nanofiber membran electrospun från PET, poly-mjölksyra / capronolactic syra (PLCL) eller poly -. mjölk-sam-glykolsyra (PLGA), såväl som kompositnanofiber (PLGA eller PET) och ultratunna PET 26 När PET-membran används med vår metalliska shooter instrument, de har en tillfällig tendens att uppvisa elektrostatisk laddning, som utmanar deras utstötning från skytten 27. Ultratunna polyimid membran kan i våra händer inte implanteras i subretinalområdet med det protokoll som beskrivs ovan ( manuskript under utarbetande). Marmor et al. har systematiskt studerat spontan resorption av subretinal vätska i iatrogena lokaliserade näthinneavlossning 38-41. Även efter manipulation i subretinalområdet dessa visade sig återabsorberas av postoperativa dagen 4 i händelselösa operationer. Laser retinopexi utförs inte för att säkra kanterna på retinotomy. Även om bakvända vid jämförelse med human kirurgi, är luft / gas tamponad inte nödvändig. Om inte kan uppnås noggrann borttagning av perifer glaskroppen, i synnerhet i den överlägsna kvadranten, detta kan i själva verket leda till gigantiska retinala tårar härrör från retinotomy platsen. Det rekommenderas endast för att utföra vätskeluftväxling med efterföljande 20% SF6 gas tamponad att rädda intraoperativa iatrogena näthinneavlossning eller i fall en viss implantatposition måste säkras. Även om mekaniskt inducerad ablation av neurala näthinnan kan orsaka RPE och fotoreceptorn skador i kaniner 42,43, varierar dess omfattning kraftigt (även med vanlig BSS) deavvaktan på faktorer som IOP, spruta typ som används, injektionsvolym med därigenom inducerad retinal sträckning, etc. Vi har också testat ofta rekommenderas Ca / Mg-fri BSS underlättas lösgör 42-44, men fann att det orsakar intraoperativ lins grumling (särskilt med förhöjd temperatur), och avsevärt fördröjer eller till och med försämrar retinal åter fäste 27. Långsam subretinal injicering av 20-30 il volym av regelbunden BSS med en spruta 100 l rekommenderas därför; injektionsnål rörelser bör vara minimal så retinotomy tätningar runt det och förhindra Bruch membran skador. Några av de iatrogena skador kan lösas genom RPE sårläkning, och den observerade relativa bevarandet av ENDA tjocklek efter återfastsättning, tyder på att RPE / fotoreceptorkomplexet kan tolerera denna försämring, som också beskrivits av andra 45. Cellbaserade läkemedel eller retinala protetik kräver preklinisk animal testning före godkännande och börjar mänskliga säkerhetsstudier. Den tidigare varierar från land till land. Kaninmodellen som beskrivs här kan tjäna som en kostnadseffektiv och mindre utmanande plattform för att etablera eller ens utföra alla krav från tillsynsmyndigheter. Dessutom kan det senare fungera för träning av kirurger i eventuella kliniska multicenterstudier eller ytterligare förbättringar av tekniken på vägen.

Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är den vanligaste orsaken till synnedsättning hos vuxna 50 år eller äldre i industriellt utvecklade länder, eftersom det orsakar förlust av det centrala seendet. Omkring 15% av dessa patienter lider av den &quot;våta&quot; formen av sjukdomen, där neovaskularisation kommer från åderhinnan och stör retinal funktion 1. Denna variant kan behandlas med en mycket effektiv behandling med upprepade intra-vitreal injektioner av antiangiogena läkemedel 2. Men den stora majoriteten av patienterna (~ 85%) lider av torr form, som kännetecknas av extracellulära avlagringar (t.ex. drusen) under näthinnans pigmentepitel (RPE). Dessa avlagringar orsaka RPE dysfunktion leder till retinal atrofi i gula fläcken. Med tanke på avsaknaden av läkande behandlingsalternativ, AMD utvecklats till en intensivt utveckla forskningsområde, där många olika läkande terapeutiska metoder testas. Kirurgisk RPE ersättning ären attraktiv framtida möjligheten att besegra denna sjukdom 3. Autolog subretinal RPE transplantation ersätter dysfunktionella eller förlorat RPE i gula fläcken, och har potential att återställa dess fysiologiska funktion 4-9. Detta kirurgisk teknik hade ett genombrott med utvecklingen av RPE differentieringsprotokoll från mänskliga embryonala stamceller (hESC) och inducerade pluripotenta stamceller (IPSC), vilket ger forskare en obegränsad cellkälla RPE för transplantation 10. RPE transplantation erkänns nu som en attraktiv först-in-människa för stamcells härledda läkemedel. Ögat erbjuder utmärkt kirurgisk åtkomst och sofistikerade in vivo verktyg för övervakning 11-13. Att transplantera RPE, är ett sätt med en minimalinvasiv leverans med en cellsuspension, alternativt, för att bättre bevara RPE egenskaper och transplantationsfunktion, konstlad bärare substrates (ställningar) för RPE ersättning övervägs 4,14,15. Stora djurmodeller krävs för preklinisk validering, men detaljerad teknisk information om djurhantering och kirurgisk teknik saknas hittills 16-23. Vi och andra 11,24 trots några bevis på motsatsen 25, föreslår användningen av en styv men ändå elastiskt bärarsubstrat eftersom det ger säkrare hantering, bevarar monolager integritet och funktionalitet. Med tiden har vi testat flera skräddarsydda instrument och tillhörande tekniker för implantation av cell bärare stöds RPE transplantationer i subretinal utrymmet (SRS). Vi utnyttjade intraoperativ videoinspelningar, in vivo scanning laser ophthalmoscopy kombineras med spektral domän optisk koherens tomografi (SLO / SD-oktober), och histologi att utvärdera implantation framgång 14,26,27. Här ger vi vårt nuvarande rekommendation för subretinal RPE implantat i kaniner,som testades i 5 olika kanin stammar, 7 cell bärarmaterial och 4 RPE cellkällor i över 150 förfaranden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>s30 ultrasonic cleaning unit</td>
			<td>Elmasonic</td>
			<td>100 4631</td>
			<td>2.75L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DE-23&#160; autoclave</td>
			<td>Systec</td>
			<td>C 2209</td>
			<td>23L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>300013 
			300995&#160; 
			301285 
			300294 
			300330&#160;</td>
			<td>1ml x3 
			2ml x3 
			5ml x1 
			10ml x1 
			20ml x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196 
			305136</td>
			<td>18G x 1&#160; 
			27G x5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#20</td>
			<td>blade#20 x3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>HARTMANN 
			LOHMANN &#38; RAUSCHER</td>
			<td>277 502 
			25 440</td>
			<td>60x40 cm x2 
			12x17 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular sticks</td>
			<td>LOHMANN &#38; RAUSCHER</td>
			<td>16 516</td>
			<td>66x5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister gauze sponges</td>
			<td>HARTMANN</td>
			<td>481 274</td>
			<td>x2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Closure strips</td>
			<td>HARTMANN</td>
			<td>540 686</td>
			<td>x4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opmi Visu CS Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/a</td>
			<td>incl. fundus imaging system BIOM II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chandelier endoillumination</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-S03503 + 
			G-S03504</td>
			<td>25G incl. trocar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light machine</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-26033</td>
			<td>Xenotron III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrectomy machine</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-60000</td>
			<td>MegaTRON S4 S4/ HPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrector</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-46301</td>
			<td>MACH2 vitreous cutter 23G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venturi cassette&#160;</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-60700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sideport-infusion cannula</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>custom&#160;</td>
			<td>1x23G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 silk suture</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>V546G</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-19135</td>
			<td>x2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-19777</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sclerotomie blade</td>
			<td>Ziemer</td>
			<td>21-2301</td>
			<td>1x23G 
			1x20G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 silk suture</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>EH6162H</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-32320</td>
			<td>x2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris forceps</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-18910</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-18950</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extendible subretinal injection needle</td>
			<td>DORC</td>
			<td>1270.EXT</td>
			<td>41G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VR scissor</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-36542</td>
			<td>25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grieshaber forceps holder</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>712.00.41</td>
			<td>23G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissor forceps tips</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>723.52</td>
			<td>23G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Implant loading station</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt oval implant trephine&#160;</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>custom-made&#160;</td>
			<td>2.4 x 1.1 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shooter dummy</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-32227</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shooter</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-S03443</td>
			<td>x1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flute needle</td>
			<td>DORC</td>
			<td>1281.SD</td>
			<td>20G (Vacuum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>24535</td>
			<td>100&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>&#160;664160</td>
			<td>100 x 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectralis Multi-Modality 
			Imaging System</td>
			<td>Heidelberg 
			Engineering</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Spectralis HRA 
			&#160;+ OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs and solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Active agent</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucadont-IS</td>
			<td>Merz Hygiene</td>
			<td>virucidal instrument disinfectant&#160;</td>
			<td>2L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucocit&#160;T</td>
			<td>Merz Hygiene</td>
			<td>Aldehyde-free instrument disinfectant</td>
			<td>2L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin 10%</td>
			<td>WDT</td>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>10ml (100mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Domitor</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>Medetomidine hydrochloride</td>
			<td>10ml (1mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>10ml (5mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neosynephrin POS 10%</td>
			<td>URSAPHARM</td>
			<td>Phenylephrine HCl</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mydriacyl</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tropicamid</td>
			<td>10ml (5mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methocel 2%</td>
			<td>Omni Vision</td>
			<td>hydroxypropyl methylcellulose</td>
			<td>10g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURI CLEAR</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Balance salt solution (BSS)&#160;</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose 5%&#160;&#160;</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>Glucose 5%&#160; solution</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Natrium-25 000</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>Heparin</td>
			<td>5ml (2500 unit/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprarenin</td>
			<td>SANOFI</td>
			<td>Epinephrine</td>
			<td>1ml (1mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triamcinolone</td>
			<td>University of Bonn pharmacy</td>
			<td>preservative-free Triamcinolone&#160;</td>
			<td>1ml (40mg/ml)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoptomax eye ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>dexamethasone 1 mg/g 
			neomycin sulfate 3,500 IU/g 
			polymyxin B sulfate 6,000 IU/g</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaisodona</td>
			<td>Mundipharma</td>
			<td>Povidon-Iod</td>
			<td>30ml (1g/10ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optive</td>
			<td>ALLERGAN</td>
			<td>sodium carboxymethylcellulose glycerol</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step by step protocol for subretinal surgery in rabbits

Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), retinitis pigmentosa, och andra RPE relaterade sjukdomar är de vanligaste orsakerna till irreversibel synförlust hos vuxna i industriellt utvecklade länder. RPE transplantation verkar vara en lovande terapi, eftersom det kan ersätta dysfunktionella RPE, återställa dess funktion, och därmed synen. Här beskriver vi en metod för att transplantera en odlad RPE monoskikt på en byggnadsställning i subretinal utrymme (SRS) hos kaniner. Efter vitrektomi xenotransplantationer levererades i SRS med hjälp av en specialtillverkad shooter som består av en 20-gauge metallmunstycke med en polytetrafluoretylen (PTFE) belagd kolv. Den nuvarande tekniken utvecklats i över 150 kanin operationer över 6 år. Postoperativ uppföljning kan erhållas med användning av icke-invasiv och upprepande in vivo imaging, såsom spektral domän optisk koherens tomografi (SD-oktober) följt av perfusionsfixerades histologi. the metod har väldefinierade steg för enkel lärande och goda resultat. Kaniner betraktas som en stor öga djurmodell användbar i prekliniska studier för klinisk översättning. I detta sammanhang kaniner är en kostnadseffektiv och kanske bekvämt alternativ till andra stora öga djurmodeller.

Resultaten från den beskrivna metoden för subretinal implantering visas i tabell 2. Engraftment under näthinnan hade en framgång på ca 61% när en kärna vitrektomi utfördes och steg upp till 76%, när glaskroppsavlossning framkallades. Dessa siffror inkluderar ca 21% av djur som dött antingen intraoperativt eller under de första 3 postoperativa dagar. Denna teknik kan användas för att implantera två ställningar på olika retinal områden i ena ögat samtidigt. Kaninerna gick postoperativa in vivo följa upp med SD-oktober och histologiska behandling som beskrivs av Stanzel et al. 27 (Figur 2). Fig. 2A visar scanning laser oftalmoskop infraröd reflektionsbild av implanterade odlade RPE på en polyestermembran (PET) efter en okomplicerad transplantation. Degloria runt implantatet motsvarar ljusmätare atrofi. Fig. 2B visar motsvarande SD-oktober, meddelande retinal, främst yttre kärnlagret (ENDA) gallring, hyper reflekterande band på SD-oktober ovan implantat, medan den neurala retina intill implantatet visar nästan normal reflektion band. Dessa resultat tyder på en atraumatisk leverans. Fig. 2C visar Hematoxiline / Eosin (H / E) fläck av implantatet som visar subretinal ärrbildning och ENDA atrofi runt retinotomy platsen sannolikt som en följd av iatrogen manipulation, en sammanhängande men oregelbunden pigmenterade skiktet över PET. Bruch membran under implantatet verkade också vara sammanhängande och choriocapillaris innehåller några spridda erytrocyter. Dessa morfologiska resultat är jämförbara med SD-oktober och stärka tesen om en atraumatisk leverans. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/53927/53927fig1.jpg" /> Fikon<html> ure 1: Loading shooter med Human iPSC-RPE odlade på PET Cell Carrier. A) visar att stansa ut ett implantat med hjälp av skräddarsydd nål. B) Bean-formade implantat skärs från cellkultur. Belastning. C) Placering av implantat före D) Lastning av shooter med implantat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra .</a> <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/53927/53927fig2.jpg" /> Figur 2: odlade humana hES-RPE på PET Cell Carrier 4 veckor i kanin subretinal rymden. A) visar SLO infraröd reflektionsbild, den gröna linjen avgränsar tvärsnittet i fig. 2B. B) Motsvarande SD-oktober C) H / E fläck, se text eller 26,27 för mer information.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:97px;"> Parameter </td><td style="width:131px;"> Begagnade inställningar </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> vitrektomi </td><td> 6000 skär / min </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Vakuum </td><td> 200 mmHg </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Stigtid </td><td> 1 sekund </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Luft </td><td> 24 mmHg </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Bevattning </td><td> 24 cmH 2 O </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Diathermy </td><td> 30% </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Parameter Setup av vitrectomy Machine. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> vitrektomi </td><td> Implantera </td><td> kaniner drivs </td><td> framgångsrik implantat </td><td> misslyckades implantat </td><td> Död </td><td> Framgång% </td></tr><tr><td> kärn vitrektomi </td><td> SÄLLSKAPSDJUR </td><td> 30 </td><td> 19 </td><td> 4 </td><td> 7 </td><td> 63,33 </td></tr><tr><td></td><td> PET + RPE </td><td> 70 </td><td> 42 </td><td> 12 </td><td> 16 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> PVD, ± plasmin w / PPV </td><td> SÄLLSKAPSDJUR </td><td> 28 </td><td> 21 </td><td> 2 </td><td> 5 </td><td> 75 </td></tr><tr><td></td><td> PET + RPE </td><td> 22 </td><td> 17 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 77,27 </td></tr></tbody></table> Tabell 2: Sammanfattning av de sista 150 verksamheten inklusive metod och Implant typ.

Watch this Scientific Journal Video about A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits at JoVE.com

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Retinal pigmentepitel (RPE) ersättnings strategier och gen-baserad terapi anses flera retinal degenerativa tillstånd. För klinisk översättning, är stora ögon djurmodeller som krävs för att studera kirurgiska tekniker som är tillämpliga på patienter. Här presenterar vi en kaninmodell för subretinal kirurgi inriktad på RPE transplantation, som är mångsidig och kostnadseffektiv.

En steg för steg protokoll för subretinal kirurgi i kaniner

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Upptäckt och Genogrouping av norovirus från Barnens Pallar Genom Taqman Ett steg RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Hur man mäter Bark Folding från MR bilder: en steg-för-steg anvisning för att beräkna lokala Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

Mätning Frailty i HIV-infekterade individer. Identifiering av sköra patienter är det första steget till förbättrande och Återföring av Frailty

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Näthinneavlossning modell i gnagare genom subretinal Injektion av natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Utföra subretinal injektioner i Gnagare att leverera pigmentepitelet celler i suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Step By Step: Microsurgical training method combining two nonliving animal models

Steg för steg: Mikroträningsmetod som kombinerar två icke-levande djurmodeller

The learning of microsurgical techniques and the maintenance of microsurgical skills have been traditionally based on the use of living animals, mainly ...

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

Heterotopisk Renal auto i en grismodell: En steg-för-steg protokoll

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality ...

Discovering Middle Ear Anatomy by Transcanal Endoscopic Ear Surgery: A Dissection Manual

Att upptäcka mellanörat anatomi av Transcanal endoskopisk öra kirurgi: en dissektion handbok

The middle ear is located in the center of the temporal bone and bears a highly complex anatomy. The recently introduced exclusively endoscopic transcanal ...

Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat

Ta nästa steg: en neural coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model för att maximera funktionell återhämtning i Rat

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Använda en kemisk biopsi för graft kvalitetsbedömning

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...