Name: efficient nucleic acid extraction and 16s rrna gene sequencing for bacterial community characterization
Uploaded: 2016-04-14T15:00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization at JoVE.com

ברצוננו להודות אליזבת ביירן, דוד Gootenberg, וקריסטינה Gosmann עבור משוב ביקורתי על הפרוטוקול; מייגן בלדריג, סקוט הנדלי, סינדי מונקו, וג&#39;ייסון נורמן להדרכה מדגם הכנה והפגנות; וונדי Garrett, קרטיס Huttenhower, דלג בתולה, וברוס ווקר לייעוץ פרוטוקול ודיונים פוריים; וג&#39;סיקה Hoisington-לופז לתמיכה רצף. עבודה זו נתמכה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס ואת NIAID (1R01AI111918). DSK קיבל תמיכה נוספת מהקרן Wellcome בורוז. MNA נתמכה על ידי מספר פרס T32GM007753 מן NIGMS, ואת פול ודייזי סורוס המלגה. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של NIGMS או NIH.

<ol>
	<li>Huttenhower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486, 207-214 (2012).</li><li>O'Hanlon, D. E., Moench, T. R., Cone, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+pH+and+microbicidal+lactic+acid+when+lactobacilli+dominate+the+microbiota.">Vaginal pH and microbicidal lactic acid when lactobacilli dominate the microbiota.</a> PloS one. 8, e80074 (2013).</li><li>Aldunate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+concentrations+of+lactic+acid+potently+inactivate+HIV.">Vaginal concentrations of lactic acid potently inactivate HIV.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68, 2015-2025 (2013).</li><li>Anahtar, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervicovaginal+bacteria+are+a+major+modulator+of+host+inflammatory+responses+in+the+female+genital+tract.">Cervicovaginal bacteria are a major modulator of host inflammatory responses in the female genital tract.</a> Immunity. 42, 965-976 (2015).</li><li>Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gnotobiotic+mouse+model+of+phage-bacterial+host+dynamics+in+the+human+gut.">Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20236-20241 (2013).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li><li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variability+of+human+vaginal+bacteria+and+relationship+with+bacterial+vaginosis.">Temporal variability of human vaginal bacteria and relationship with bacterial vaginosis.</a> PloS one. 5, e10197 (2010).</li><li>Dols, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+identification+of+clinically+relevant+vaginal+bacteria+in+relation+to+bacterial+vaginosis.">Microarray-based identification of clinically relevant vaginal bacteria in relation to bacterial vaginosis.</a> American journal of obstetrics and gynecology. 204, 301-307 (2011).</li><li>Segata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+microbial+community+profiling+using+unique+clade-specific+marker+genes.">Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes.</a> Nature methods. 9, 811-814 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample.">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4516-4522 (2011).</li><li>Ravel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+microbiome+of+reproductive-age+women.">Vaginal microbiome of reproductive-age women.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4680-4687 (2011).</li><li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+communities+in+women+with+bacterial+vaginosis:+high+resolution+phylogenetic+analyses+reveal+relationships+of+microbiota+to+clinical+criteria.">Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria.</a> PloS one. 7, e37818 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature methods. 7, 335-336 (2010).</li><li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+mothur:+open-source,+platform-independent,+community-supported+software+for+describing+and+comparing+microbial+communities.">Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities.</a> Applied and environmental microbiology. 75, 7537-7541 (2009).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPARSE:+highly+accurate+OTU+sequences+from+microbial+amplicon+reads.">UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.</a> Nature. 10, 996-998 (2013).</li><li>AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen Available from: <a target="_blank" href="https://http://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna-sample-technologies/dna-rna-protein/allprep-dnarna-mini-kit/">https://http://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna-sample-technologies/dna-rna-protein/allprep-dnarna-mini-kit/</a> (2015)</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li><li>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent. Invitrogen Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp07581.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp07581.pdf</a> (2008)</li><li>DeSantis, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greengenes,+a+chimera-checked+16S+rRNA+gene+database+and+workbench+compatible+with+ARB.">Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.</a> Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).</li><li>Vazquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMPeror:+a+tool+for+visualizing+high-throughput+microbial+community+data.">EMPeror: a tool for visualizing high-throughput microbial community data.</a> GigaScience. 2, 16 (2013).</li><li>Eren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+diversity+of+Gardnerella+vaginalis+in+the+genitourinary+tract+microbiota+of+monogamous+couples+through+subtle+nucleotide+variation.">Exploring the diversity of Gardnerella vaginalis in the genitourinary tract microbiota of monogamous couples through subtle nucleotide variation.</a> PloS one. 6, e26732 (2011).</li><li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature biotechnology. 31, 814-821 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הנה אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי ואפיון של שכיחותם חיידקי יחסיות בתוך משטח וגינאלי האדם. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם עבור סוגי מדגם אחרים, כגון שרפרף מטליות של אתרים אחרים בגוף, ועל דגימות שנאספו ממגוון רחב של גורמים. הפקת חומצות גרעין ממכות חרוז בתמיסה שנאגרה של פנול כלורופורם מאפשרת בידוד של שני DNA ו- RNA, וזה חשוב במיוחד כשעובד עם דגימות יקרות שנאספו באמצעות מחקרים קליניים. ב- DNA של החיידק המבודד מצוין לזיהוי טקסונומי חיידקים והרכבה גנומית, בעוד אוסף סימולטני של רנ&quot;א מספק את ההזדמנות כדי לקבוע חיידקים פונקציונליים, מארח, וכן תרומות ויראלית דרך-seq RNA. הפרוטוקול המתואר משתמש קבוצת פריימר צעד אחד תוקפת כי נפרסה בהצלחה על מגוון רחב של סוגי מדגם, כוללים אדם, כלבים, דגימות סביבתיות 10 </sup&gt;. הזמינות של אלף פריימרים המינימרקטים מאפשרת ריבוב של דגימות וחיסכון עצום בעלויות רצף. העלות המלאה (כולל כל ריאגנטים, ריצת רצף אחד, פריימרים אבל לא ציוד) היא כ -20 $ לדגימה כאשר 200 דגימות multiplexed. בנוסף, יש שחזור גבוה מאוד כאשר מטליות מרובות מאותו אתר מדגם מעובדים באופן נפרד באמצעות הצינור כולו. בסך הכל, הפרוטוקול הוא עלות יעיל, גמיש, אמין, דיר. חלק מיצוי חומצות הגרעין של פרוטוקול זה הוא מוגבל על ידי אמצעי הבטיחות הנדרש כאשר עובדים עם פנול כלורופורם, ואת האתגרים של מיכון הצינור על תפוקה גבוהה, 96-גם בפורמט צלחת. בנוסף, המכות החרוזות הנמרצות המשמשות מזמרת תמוגה מכאנית ב- DNA של החיידק לכ 6 שברי kilobase; אם כבר קטעי דנ&quot;א נדרשים עבור יישומים במורד זרם, המשך של מכות החרוזותhould להתקצר. המגבלות של חלק זיהוי החיידקים של פרוטוקול זה הן אינהרנטי לכל שיטה המסתמכת על רצף גן 16S rRNA. 16S rRNA הרצף אידיאלי לזיהוי חיידקים מהמין ואפילו מינים ברמה, אבל לעתים רחוקות מספק זיהוי רמת מתח. בעוד האזור משתנה V4 הגן 16S rRNA מספק אפליה חזקים בקרב רוב מינים של חיידקים 11, שיטות חישוביות נוספים כגון Oligotyping 31 ייתכן שיהיה צורך להשתמש בהם כדי לזהות מינים מסוימים דווקא, כגון crispatus לקטובצילוס. לבסוף, מידע על היכולות התפקודיות חיידקים המדויקים בתוך מדגם מסוים לא ניתן לקבוע על ידי רצף גן 16S rRNA לבד, אם כי בפרוטוקול זה מאפשר מיצוי של DNA הגנום כולו ו- RNA שיכול לשמש לקראת מטרה זו. השלב הקריטי ביותר להבטחת הצלחה עם פרוטוקול זה הוא לוקח בזהירות רבה כדי למנוע זיהום durאוסף מדגם ing, מיצוי חומצות גרעין, הגברת PCR. להבטיח סטריליות בעת איסוף דגימה ידי לבישת כפפות נקיות בעזרת מקלוני סטרילי, צינורות, ומספריים. כדי להעריך עבור זיהום של חומרים האוספים, לאסוף דגימות בקרה שליליות על ידי נחת מטליות ללא שימוש נוספים ישירות לתוך צינורות הובלה בעת הדגימה. במעבדה, לבצע את כל השלבים טרום הגברה במנדף מעוקר המכיל אספקה ​​לחטא רק ושימוש כיתה מולקולרית רק עם ריאגנטים חינם-DNA. במהלך חילוץ חומצות גרעין, למנוע זיהום צולב באמצעות מלקחיים סטריליות חדשים וכפפות טריות עם כל דגימה, ושמירה על כל הצינורות סגורים אלא בשימוש. עיבוד מטליות בשימוש במקביל מבטיח סטריליות של שני אוסף המדגם וסחיט חומצות גרעין; המטליות בשימוש לא אמורות להניב גלולה לאחר ממטרי isopropanol ושטיפת אתנול. אם גלול אכן מופיע, לבצע הגברת גני 16S rRNA לקבוע מקור אפשרי שלהזיהום (למשל, הנוכחות של סטרפטוקוקוס או סטפילוקוקוס יצביע זיהום בעור). בנוסף, לבצע רחבות PCR ללא תגובות שליטת תבנית במקביל על מנת להבטיח כי ריאגנטים PCR והתגובות לא זוהמו. אם להקה מופיעה אין שליטת תבנית, וזורק את ריאגנטים וחזור ההגברה עם ריאגנטים טריים. נקיטת אמצעי זהירות אלה תבטיח רצף מוצלח של החיידקים של עניין. שלב ההגברה PCR נוטה לחייב את התקלות ביותר. הגברה בקבוצות של שנים עשר דגימות מספק איזון בין יעילות ועקביות. העדר מוחלט של להקות, מעבר לכל הדוגמאות ב סט הגברה נתון מצביע על כשל מערכתי, למשל, שוכח להוסיף מגיב או שגוי תכנות thermocycler. היעדרם של הלהקה מתוך כמה דוגמאות לרוב בשל טעות אנוש, ואת amplifications צריך להיות מחדש run עם אותו הזיווג של מדגם פריימר ההפוך. במקרה של היעדרות המשך להקה, המדגם יכול להיות מחדש מוגבר באמצעות פריימר הפוכה עם ברקוד שונה. כשלי הגברה חוזרים עם פריימרים הפוכים מרובים עשויים להצביע מעכב נוכחי במדגם. במקרה כזה, לנקות את ה- DNA עם טור לעתים קרובות יסיר מעכבים מבלי לשנות שכיחותם בקטריאלי יחסית משמעותי. אם להקות מרובות נובעות לאחר הגברה, מחדש להגביר המדגם עם ברקוד פריימר הפוכה שונים. בנוסף למניעת זיהום סביבה ועל הבטחת הגברה של מוצר ספציפי אחד, רצף מוצלח מסתמך על טיפול בעת הכנת ברכת הספרייה. המטרה היא לשלב כמויות equimolar של כל amplicons של מדגם על מנת להבטיח כ המספר הזהה של רצף קורא לדגימה. אם ריכוזי חומצת הגרעין לפני ההגברה ניתנות להשוואה, פשוט הוסיף כמויות שווות של כל saamplicons של mple מספיק בעת יצירת ברכת הספרייה. עם זאת, אם ריכוזי חומצת הגרעין שונים במידה רבה והוסיפו נפח שווה, המדגם עם ריכוז חומצות גרעין הנמוך ייוצג גרוע עם מספר נמוך של הקורא. במקרה זה, ניתן להוסיף נפח גבוה יותר של amplicons מן מדגם הריכוז הנמוך בהתבסס על העצמה היחסית של להקת ג&#39;ל. לחלופין, אפשר יותר בקפדנות להסיר פריימרים מן amplicons הפרט, לכמת ריכוז amplicon של מדגם בודד באמצעות ערכת כימות dsDNA fluorometric, ודווקא לשלב כמויות equimolar של כל דגימה. לאחר ברכת amplicon מאוזנת היטב מופקת, הוא הופך להיות קריטי כדי למדוד את הריכוז של הברכה בזהירות. דילול זהיר לאחר וספייק-in עם PhiX להגדיל את המורכבות הקריאות היא קריטיות להשגת תוצאות רצף אופטימליות. sequencers תפוקה גבוהה המשתמש sequencing בסינתזה רגיש מאוד לצפיפות מצרר על תא הזרימה. טוען בריכת הספריה מרוכזת מדי תגרום overclustering, עם ציוני איכות נמוכים יותר, פלט נתונים נמוך, ו -32 demultiplexing מדויק. טוען בריכת ספרייה שהיא לדלל מדי יביא גם פלט נתונים נמוכים. בזהירות לכימות ברכת הספרייה לפני הרצף יהיה להבטיח תוצאות אופטימליות. 16S rRNA רצף הגן מספק הערכה מקיפה של החיידקים הנוכחיים בתוך מדגם נתון הוא צעד ראשון קריטי בדור שערה. הנוכחות של מערך עשיר של מטה נוסף מאפשרת לחוקר לבחון את קשר בין מיני חיידקים מסוימים וגרם ביולוגיים חשובים. יתר על כן, אותו המידע 16S יכול לשמש כדי להסיק את פונקציות חיידקים באמצעות כלים כגון PICRUSt 33. המטרה הסופית היא להשתמש 16S אפיון לזהות עמותות רומן כי יכול להיותעוד נבדק ומאומת במערכות מודל, מוסיף גוברת ההבנה שלנו של השפעת Microbiome החיידקים על בריאות אדם ועל מחלותיו.

האדם נמוך במערכת הרבייה, מערכת העיכול, מערכת הנשימה, העור הם יישבו על ידי קהילות חיידקי מורכבות שאינן קריטית לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותמיכה הבריאות של המארח 1. למשל, לקטובצילוס מסוימים ליצור סביבה עוינת עבור פתוגנים על ידי acidifying בכספת הנרתיק, ייצור effectors מיקרוביאלית ויסות חסינות המארח המקומי 2-4. האהדה הגוברת לחשיבות של Microbiome החיידקים גם גדלה עניין באפיון קהילות חיידקים בהקשרים קליניים רבים. כאן נתאר שיטה כדי לקבוע את ההרכב של Microbiome חיידקי מטליות איברי המין. הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות עבור דגימות צואה מטליות שנאספו ממקומות אנטומיים אחרים ומינים מארחים אחרים. בשל המגבלות המובנות במספר הדגימות שניתן נאספות ונשמרו מן הרבעה נתונהמשתתף y, פרוטוקול זה נועד לחלץ DNA, RNA, ואפשרות אפילו חלבון מן ספוגית יחידה באמצעות 5,6 שיטת הכאת חרוז המבוססת מותאמת פנול, כלורופורם. השילוב של הפרעה הפיסית של קירות תא חיידק עם הכאת חרוז ושיבוש כימי עם דטרגנטים מאפשר תמוגה מהירה של גראם חיובי, גראם שלילי, וחומצה-מהר חיידקים ללא צעדי עיכול אנזימטי נוספים. כדי להשיג RNA באיכות גבוהה, מומלץ להשתמש מטליות יבשות כי הוחזקו בבית או מתחת ל -4 מעלות צלזיוס מיד לאחר איסוף במהלך ההובלה למעבדה (אם רלוונטי), לטווח ארוך מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את Microbiome החיידקים בתוך מדגם נתון, הליך זה מנצל רצף amplicon גן 16S rRNA, אשר נמצא כעת את האמצעים הכי חסכוני להקצות הטקסונומיה של חיידקים מקיפים ולבצע כימות יחסיות. שיטות חלופיות כוללות ממוקד 7 qPCR, מנהג microarrays 8, ו-הגנום כולו רצף 9. גן 16S rRNA מכיל תשעה אזורי hypervariable, ואין הסכמה לגבי אזור V האופטימלי שממפה ללימודי Microbiome בנרתיק. כאן אנו משתמשים סט פריימר 515F / 806R ולבנות על צינור שעיצב Caporaso et al. 10-12. Caporaso et al. &#39;S 515F / 806R סט פריימר מאפשר ריבוב של מאות דגימות על ריצה רצף יחיד בשל הזמינות של אלפי פריימרים המינימרקטים תוקף ותאימות עם פלטפורמות רצף Illumina. בניגוד פריימר 27 ו / 338R של הפרויקט Microbiome האדם להגדיר 13, 515F / 806R גם ביעילות מגביר Bifidobacteriaceae ובכך במדויק לוכדת Gardnerella vaginalis, חבר חשוב של הקהילה חיידקים בנרתיק אצל חלק מהנשים. לחלופין, זוג פריימר 338F / 806R שמש בהצלחה עבור pyrosequencing של דגימות מנרתיק 14 וזוג פריימר 515F / 926R יש recently מתפרסם עבור סידור הדור הבא 12. לבסוף, פרוטוקול זה מספק הוראות בסיסיות לבצע 16S ניתוח amplicon באמצעות תובנות כמותי לתוך אקולוגיה מיקרוביאלית (QIIME) תוכנה חבילה 15. יישום מוצלח של פקודות QIIME המתוארות כאן מניב טבלה המכילה שכיחותם טקסונומיות חיידקים עבור כל דגימה. רבים צעדים נוספים בקרת איכות, שיטות הסיווג הטקסונומי, וצעדים ניתוח ניתן לשלב ניתוח, כמתואר בפירוט באתר QIIME (http://qiime.org/index.html). אם הניתוח יבוצע על מחשב אפל, חבילת MacQIIME 16 מספקת התקנה קלה של QIIME ויחסי התלות שלה. חבילות תוכנה אלטרנטיביות לניתוח רצף גן 16S rRNA כוללות Mothur 17 UPARSE 18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Any other DNA quantification method will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq or HiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catch-All Sample Collection swab</td>
			<td>Epibio</td>
			<td>QEC89100</td>
			<td>Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELIMINase</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>04-355-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 &#181;m)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw-cap tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
			<td>For bead beating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 5M NaCl</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24740-011</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl</td>
			<td>Ambion (Invitrogen)</td>
			<td>AM9856</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Ambion (Invitrogen)</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1311-200</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-free distilled water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Molecular Biology Grade, for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol BioReagent, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9730</td>
			<td>Warning: Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M Sodium Acetate, pH 5.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9740</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile polystyrene forceps, PS</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-06443-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, clear, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>MoBio</td>
			<td>17000-11</td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7295-0.5mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1492-3900</td>
			<td>Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3121-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X TAE buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo (Fisher)</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50bp GeneRuler Ladder</td>
			<td>Thermo (Fisher)</td>
			<td>SM0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClean PCR Clean-up Kit</td>
			<td>MoBio</td>
			<td>12500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P11496</td>
			<td>An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515F (forward primer) 5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGAG 
			ATCTACACTATGGTAATTGT 
			GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &#181;M. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded 
			_primers_515F_806R.txt</td>
			<td>IDT is recommended</td>
			<td></td>
			<td>If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 &#956;M. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and 
			_resuspension.doc.&#160; **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read 1 Sequencing Primer 5&#39;-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read 2 Sequencing Primer 5&#39;-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Sequencing Primer 5&#39;-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td>Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient nucleic acid extraction and 16s rrna gene sequencing for bacterial community characterization

ישנה הערכה גוברת לתפקיד של קהילות חיידקים כמו מאפננים חשובים לבריאות אדם ומחלות. טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה אפשרו לאפיון מהיר ויעיל של קהילות חיידקי באמצעות רצפי גנים 16S rRNA ממגוון מקורות. למרות כלים זמינים עבור ניתוח רצף 16S rRNA יש זרימות עבודה חישובית סטנדרטיות, עיבוד מדגם להפקת DNA נשאר מקור המשך של השתנות בין מחקרים שונים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מ מטליות. אנחנו גם להתוות שיטות במורד הזרם עבור סידור הגן 16S rRNA, כולל דור של ספריות רצף, בקרת איכות נתונים, וניתוח רצף. זרימת העבודה יכולה להכיל סוגי דגימות מרובים, כוללים שרפרף מטליות שנאספו במגוון מיקומים אנטומיים של פונדקאי. בנוסף, התאושש DNA ו- RNA ניתן להפריד ומשומשיםעבור יישומים אחרים, כולל רצף הגנום כולו או-seq RNA. השיטה המתוארת מאפשרת גישת עיבוד משותפת סוגי מדגם מרובים להכיל ניתוח במורד זרם של מידע גנומי, metagenomic ו תעתיק.

<html> הסקירה הכללית של הפרוטוקול המאפשר קביעת שכיחותם חיידקי יחסים מן ספוגית באמצעות רצף גן 16S rRNA, מוצגת באיור 1 .the פרוטוקול כבר מותאמת למשטח מנרתיק אדם, אך ניתן להתאים בקלות עבור אתרי דגימה הרירית ביותר ומארחים אחרים. איור 2 מדגים את ה- DNA באיכות הגבוהה ו- RNA כי ניתן לבודד באמצעות פרוטוקול הכאת חרוז. איור 3 ממחיש הגברת PCR מוצלחת של 12 דגימות, שבו כל הגברה עם מדגם ניב להקה חזקה אחת של הפוליטיקלי גודל כל פקד במים לא ניב להקה. תרשים 4 מתארים את כימות של ברכת הספרייה הסופית לפני הסידור. איור 5 מראה פרופיל איכות רצף טיפוסי אחרי ריצת MiSeq חד סוף -300 נ&quot;ב. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53939 / 53939fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. סכמטי סקירה כללית של פרוטוקול. ראשית, חומצות גרעין מופק ספוגית ידי הכאת חרוז בתמיסה שנאגרו המכיל פנול, כלורופורם ולאחר isoamyl אלכוהול. אזור משתנה 4 של הגן 16S rRNA מוגבר אז מן חומצות גרעין וכתוצאה מכך באמצעות PCR. amplicons PCR ממרחק של עד מאות דגימות מצורפות יחד להפיק ולרצף על בטווח אחת. רצפים וכתוצאה מכך מותאמות מסד נתונים התייחסות לקבוע שכיחותם בקטריאלי יחסית. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע בעוד כשלושה ימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig2.jpg" /> איור 2. באיכות גבוהה חומצות גרעין חילוץ באמצעות פנול: חרוז כלורופורם מכות Method. (א) איכות DNA, כפי שהוערך באמצעות ספקטרופוטומטר. יחס A260 / A280 בין 1.8 לבין 2.0 מציין חומצות גרעין טהור שאינו מזוהם עם פנול או חלבון. (ב) לאחר טור לנקות, פרוטוקול זה יכול להניב RNA באיכות גבוהה, שמסומן על ידי 16S ו 23S חזק פסגות rRNA. (C) שפלת RNA יכולה להתרחש אם המדגם אינו נשמר קר לאחר איסוף (במהלך הובלה ואחסון) או אם RNases נוכח במהלך עיבוד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig3.jpg" /> אישור איור 3. 16S rRNA מוצלח ג&#39;ין הגברה שימוש 515F ו המינימרקטים 806R פריימר סט. אלקטרופורזה למעלה) ג&#39;ל משמש כדי לאשר את קיומו של להקה אחת כ -380 זוגות בסיסים in כל המדגם היה מוגבר בעזרת תבנית. היעדרם של להקה מציין הגברה מוצלחת; זה בדרך כלל עקב טעויות אנושות תגובת PCR ממדגם כי יש לחזור. תחתי) אין תבנית (מים) שולט לרוץ במקביל עם אותו זוג פריימר לא צריך מתנת להקה. הנוכחות של להקה בבקרת המים מציינת ריאגנטים מזוהמים; להתעלמות ריאגנטים שעשויים להיות מזוהם מחדש לעשות את amplifications PCR היא של חלוקת בקרת התבנית ומים כי זוג פריימר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig4.jpg" /> איור 4. כימותים של ריכוז ברכת הספרייה הסופית ותיקוף של גודל הספרייה. לאחר איגום amplicons המדגם הבודד, הריכוז דואר של ברכת הספרייה הסופית חייב להיות נחוש. ברכת הספרייה לאחר מכן יש מדוללת יותר כדי להשיג ריכוז 2 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig5.jpg" /> איור 5. נציגים ברים מגרש של ציוני איכות הרצף במיקום כל של הקריאה. זה נורמלי איכות הרצף לרדת אחרי 200 זוגות בסיסים, אבל תוצאת האיכות הממוצעת צריכה להישאר מעל 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> #SampleID </td><td colspan="2"> ברקוד <br/&gt; רצף </td><td colspan="3"> LinkerPrimer סדר פעולות </td><td> rcbcPrimer </td><td> SampleType </td><td> הוֹצָאָה קְבוּצָה </td><td> הַגבָּרָה צַלַחַת </td><td> תֵאוּר </td></tr><tr><td> ניתן למצוא קובץ מיפוי למשל #An בכתובת: http://qiime.org/_static/Examples/File_ פורמטים / דוגמא_ Mapping_ file.txt </td><td colspan="2"></td><td colspan="3"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> AG2350 </td><td colspan="2"> TCCCTTGTCTCC </td><td colspan="3"> CCGGACTACHVGGGTWTCTAAT </td><td> rcbc000 </td><td> cervical סְפוֹגִית </td><td> 1 </td><td> א </td><td></td></tr></tbody></table> תבנית קובץ מיפוי טבלה 1.. Creaטינג קובץ מיפוי מדויק וממצה הוא קריטי לביצוע הפרוטוקול בהצלחה. קובץ המיפוי אינו נדרש רק לביצוע QIIME, אבל זה גם מאפשר לחוקר לשמור על הקשר בין הברקוד המדגם מטה, כדי לנתח את הנתונים עבור כל הטיות שיטתיות (למשל, יצווה אל תצווה וריאציה), ולקבוע מתאמים מעניינים בין מטה ואוכלוסיות חיידקים. קובץ מיפוי חשוף עצמות סופק, אבל משתמשים מעודדים מוסיפים עמודות רבות בעלי metadata ככל האפשר. דוגמאות של metadata נוסף משטח וגינאלי כולל אוסף הגיל, התאריך / השעה של ספוגית של המשתתף, סוג מניעת הורמונליים (אם רלוונטי), תוצאות בדיקות זיהום המועברות במגע מיני, וכו &#39; <img alt="Suppliment 1" src="/files/ftp_upload/53939/53939suppliment.jpg" /> רשימה משלימה קובץ 1. של המינימרקטים הפוך פריימר רצפים 10 </sup&gt;. השלוש העמודות הראשונות ניתן להשתמש כדי להשלים את קובץ המיפוי, ואת העמודה האחרונה מספקת רצף פריימר כולו להזמנת מטרות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/Supplemental_Code_File.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization at JoVE.com

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

אנחנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מן מטליות לאפיון של קהילות חיידקי באמצעות רצף amplicon הגן 16S rRNA. השיטה מאפשרת גישה עיבוד משותף סוגי מדגם מרובים ויכול להכיל מספר תהליכים טיפוליים במורד הזרם.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

ניתוח ובניית מבני חומצות גרעין עם 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

פרוטוקול מודרך לקבלת צואה אפיון חיידקים על ידי מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...