Name: efficient nucleic acid extraction and 16s rrna gene sequencing for bacterial community characterization
Uploaded: 2016-04-14T15:00:00
Duration: 12 min 37 s
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我々は、プロトコル上の重要なフィードバックのためにエリザベス・バーン、デイヴィッドGootenberg、クリスティーナGosmannに感謝したいと思います。サンプル調製の指導やデモのためのミーガン・ボルドリッジ、スコット・ハンドリー、シンディモナコ、そしてジェイソン・ノーマン。プロトコルのアドバイスと実りある議論のためのウェンディ・ギャレット、カーティスHuttenhower、スキップヴァージン、そしてブルース・ウォーカー。および配列決定をサポートするためのジェシカHoisington-ロペス。この作品は、ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団とNIAID（1R01AI111918）によってサポートされていました。 DSKは、バローズウェルカム基金から追加支援を受けました。 MNAは、受賞数NIGMSからT32GM007753、とポールとデイジー・ソロスフェローシップによってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIGMSまたはNIHの公式見解を示すものではありません。

<ol>
	<li>Huttenhower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome.">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486, 207-214 (2012).</li><li>O'Hanlon, D. E., Moench, T. R., Cone, R. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample.">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4516-4522 (2011).</li><li>Ravel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+microbiome+of+reproductive-age+women.">Vaginal microbiome of reproductive-age women.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4680-4687 (2011).</li><li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+communities+in+women+with+bacterial+vaginosis:+high+resolution+phylogenetic+analyses+reveal+relationships+of+microbiota+to+clinical+criteria.">Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria.</a> PloS one. 7, e37818 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature methods. 7, 335-336 (2010).</li><li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+mothur:+open-source,+platform-independent,+community-supported+software+for+describing+and+comparing+microbial+communities.">Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities.</a> Applied and environmental microbiology. 75, 7537-7541 (2009).</li><li>Edgar, R. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greengenes,+a+chimera-checked+16S+rRNA+gene+database+and+workbench+compatible+with+ARB.">Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.</a> Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).</li><li>Vazquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMPeror:+a+tool+for+visualizing+high-throughput+microbial+community+data.">EMPeror: a tool for visualizing high-throughput microbial community data.</a> GigaScience. 2, 16 (2013).</li><li>Eren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+diversity+of+Gardnerella+vaginalis+in+the+genitourinary+tract+microbiota+of+monogamous+couples+through+subtle+nucleotide+variation.">Exploring the diversity of Gardnerella vaginalis in the genitourinary tract microbiota of monogamous couples through subtle nucleotide variation.</a> PloS one. 6, e26732 (2011).</li><li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences.">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature biotechnology. 31, 814-821 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここでは、人間の膣スワブ内での相対的な細菌存在量の同定および特徴付けのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、容易にそのような糞便や他の身体部位のスワブのような他のサンプルタイプ、および多種多様な供給源から収集されたサンプルに適合させることができます。フェノールおよびクロロホルムの緩衝溶液中のビーズビーティングによる核酸の抽出は、臨床研究を通じて収集貴重なサンプルを扱うときに特に重要である、DNAとRNAの両方を単離することができます。 RNAの同時コレクションは、RNA-seqのを介して機能性細菌、ホスト、およびウイルスの寄与を決定する機会を提供しながら、単離された細菌DNAは、細菌の分類学的同定およびゲノムアセンブリに最適です。記載したプロトコルを正常ヒト、イヌ、および環境サンプル10を含むサンプルタイプの広範囲に展開された検証一工程プライマーセットを使用して</suP&gt;。バーコードプライマーの何千人もの利用可能性は、シーケンシングコストをサンプルと膨大な貯蓄の多重化を可能にします。 200サンプルが多重化されているとき（全ての試薬、単一の配列決定ラン、及びプライマーではなく、機器を含む）完全なコストは、サンプルあたり約$ 20です。また、同じサンプルサイトからの複数の綿棒がパイプライン全体を通して独立して処理されている非常に高い再現性があります。全体的に、プロトコルは、コスト、効率的で柔軟性、信頼性、および再現性があります。 このプロトコルの核酸抽出部分をフェノール及びクロロホルムで作業する際に必要な安全上の注意事項、および高スループット、96ウェルプレートフォーマットへのパイプラインを自動化するという課題によって制限されます。また、積極的なビーズの鼓動は約6キロベースの断片に機械的溶解ばさみのための細菌のDNAを使用します。より長いDNA断片を、ビーズビーティング秒の期間、下流側アプリケーションに必要である場合houldを短縮します。このプロトコルの細菌同定部分の制限は、16S rRNA遺伝子の塩基配列決定に依存している任意の方法に固有です。 16S rRNAの塩基配列決定属、さらには種レベルに細菌同定のための理想的ですが、まれに歪みレベルの識別を提供しません。 16S rRNA遺伝子のV4可変領域は、ほとんどの細菌種11の間で強固な識別を提供するが、そのようなOligotyping 31のような付加的な計算方法は、正確にこのようなラクトバチルスcrispatusなどの特定の種を同定するために使用される必要があり得ます。このプロトコルは、この目的に向けて使用することができる全ゲノムDNAとRNAの抽出を可能にしても最終的には、特定のサンプル内の正確な細菌の機能的能力についての情報は、単独で、16S rRNA遺伝子の配列決定により決定することができません。 このプロトコルで成功を確保するために最も重要なステップは、汚染のDURを防止するために、細心の注意を取っていまする試料収集、核酸抽出、およびPCR増幅。清潔な手袋を着用してと滅菌綿棒、チューブ、はさみを使って、サンプル収集の時に無菌性を確認してください。コレクション物質の汚染について評価するために、サンプリング時に輸送管に直接追加未使用の綿棒を配置することによって、陰性対照スワブを収集します。ラボでは、唯一の除染物資を含有し、唯一の分子グレード、DNAフリー試薬を用いて滅菌フード内のすべての前の増幅の手順を実行します。核酸抽出時には、各サンプルに新しい滅菌ピンセット、新鮮な手袋を使用し、使用中の場合を除き閉じたすべてのチューブを維持することによって交差汚染を防止します。並行して、未使用の綿棒を処理するサンプル収集及び核酸抽出の両方の無菌性を保証します。未使用の綿棒は、イソプロパノール沈殿及びエタノール洗浄後、ペレットを得てはなりません。ペレットが表示されない場合は、の可能性のあるソースを決定するために、16S rRNA遺伝子の増幅を行います汚染（ 例えば、 連鎖球菌やブドウ球菌の存在は、皮膚の汚染を示すであろう）。また、PCR試薬と反応が汚染されていないことを確認するために並列に鋳型なしコントロール反応でPCR増幅を行います。バンドはテンプレートなしのコントロールに表示されている場合、試薬を廃棄し、新たな試薬と増幅を繰り返します。これらの予防措置をとることは目的の細菌の正常なシーケンシングを保証します。 PCR増幅工程は、ほとんどのトラブルシューティングを必要とする傾向があります。 12サンプルのセットで増幅し、効率性と一貫性の間のバランスを提供します。与えられた増幅セット内のすべてのサンプル全体でのバンドの完全な欠如は、 例えば、試薬を追加し忘れたり、間違ってサーモサイクラーのプログラミングを、系統的な障害を示します。いくつかのサンプルからのバンドの不在は通常、ヒューマンエラーによるものであり、増幅は再-Rでなければなりませんサンプルおよびリバースプライマーの同じペアとアン。バンドの連続不在の場合には、試料は、異なるバーコードを有するリバースプライマーを使用して再増幅することができます。複数のリバースプライマーを用いて繰り返し増幅の失敗は、試料中に存在する阻害剤を示すことができます。その場合には、カラムでDNAを洗浄することは、しばしば大幅に相対的な細菌の存在量を変更することなく、阻害剤を除去します。複数のバンドが増幅後に生じた場合は、異なるリバースプライマーのバーコードでサンプルを再増幅します。 ライブラリー・プールを作成する際に、環境汚染を防止し、単一の特定の製品の増幅を確保することに加えて、成功したシークエンシングは、介護に依存しています。目標は、約シーケンシング同じ数のサンプルあたりの読み込みを保証するために、各サンプルのアンプリコンの等モル量を組み合わせることです。増幅前に核酸濃度が同等である場合は、単純に各SAの等容量を追加しますmpleのアンプリコンライブラリー・プールを作成するときには十分です。核酸の濃度が非常に異なると等量で添加されている場合には、低い核酸濃度を有するサンプルは不十分読み取りの低い数で表されます。この場合には、ゲルのバンドの相対強度に基づいて、低濃度サンプルからアンプリコンのより高い量を添加することが可能です。あるいは、より厳密に各試料の等モル量を、個々のアンプリコンのプライマーを除去蛍光のdsDNA定量キットを使用して、個々のサンプルのアンプリコンの濃度を定量し、正確に組み合わせることも可能です。 バランスのとれたアンプリコンのプールが生成されると、それは慎重にプールの濃度を測定することが重要となります。その後の慎重な希釈およびスパイクでPHIXで読み取り複雑さを増加させるためには、最適な配列決定の結果を達成するために重要です。 sequenを使用するハイスループットシーケンサー合成によってcingフローセル上のクラスタ密度に非常に敏感です。あまりにも低い品質スコア、下位データ出力、および不正確な分波32と、overclusteringになります集中しているライブラリープールをロードします。あまりにも希薄されたライブラリーのプールをロードすると、低データ出力になります。慎重に配列決定前にライブラリープールを定量化することは、最適な結果を保証します。 16S rRNA遺伝子配列決定は、所与の試料内に存在する細菌の包括的な評価を提供し、仮説生成における絶対的に重要な最初のステップです。さらに、メタデータの豊富なセットの存在は、特定の細菌種及び重要な生物学的要因との関連性をテストするための研究を可能にします。また、同一の16S情報は、PICRUSt 33のようなツールを使用して細菌の機能を推定するために使用することができます。最終的な目標とすることができる新規の関連付けを識別するために16S特徴付けを使用することですさらに、ヒトの健康および疾患に対する細菌microbiomeの影響の成長を続ける当社の理解に追加、モデル系でテストおよび検証。

人間の下生殖器官、消化器系、呼吸器、皮膚を組織の恒常性を維持し、ホスト1の健康をサポートするために重要である複雑な細菌群集によって植民地化されています。例えば、特定の乳酸菌は、膣円蓋を酸性抗菌エフェクターを生成し、ローカルホスト免疫2-4を調節することにより、病原体のための無愛想環境を作成します。細菌microbiomeの重要性の高まり感謝も多くの臨床の状況で細菌群集を特徴づけるの関心を増大させました。ここでは、生殖器スワブからの細菌microbiomeの組成を決定する方法を説明します。プロトコルは、容易に他の解剖学的位置および他の宿主種から収集便試料及びスワブ用に修正することができます。 与えられたスタッドから収集し、保存することができるサンプル数に固有の制限のためにYの参加者は、このプロトコルは、適合フェノール-クロロホルムベースのビーズビーティング法5,6を使用して単一の綿棒から潜在的にDNA、RNA、さらにタンパク質を抽出するために設計されました。洗剤とビーズビーティングおよび化学的破壊を有する細菌の細胞壁の物理的破壊の組み合わせは、追加の酵素消化段階なしに、グラム陽性、グラム陰性、および抗酸菌の迅速な溶解を可能にします。高品質のRNAを得るためには、すぐに回収後、実験（該当する場合）への輸送中に、またはC°4以下に保たれた乾燥綿棒を使用することをお勧めし、-80℃で長期間保存されます。 与えられた試料内の細菌microbiomeを決定するには、この手順は、現在、総合的に細菌の分類を割り当て、相対定量を行うための最も費用対効果の高い手段である16S rRNA遺伝子アンプリコンのシーケンシングを利用します。代替方法では、標的のqPCR 7、カスタムmicroarrを含みますAYS 8、及び全ゲノム配列9。 16S rRNA遺伝子は、9超可変領域を含み、膣microbiome研究のためのシーケンスに最適なV領域に関するコンセンサスはありません。ここでは、515F / 806Rプライマーセットを使用し、Caporaso らによって設計されたパイプラインの上に構築。10-12。 Caporaso らの515F / 806Rプライマーセットが原因検証バーコードプライマーとイルミナシーケンシングプラットフォームとの互換性の何千もの可用性に単一の配列決定ランでのサンプルの何百もの多重化を可能にします。人間Microbiomeプロジェクトの27F / 338Rプライマーセット13とは異なり、515F / 806Rも有効Bifidobacteriaceaeを増幅し 、したがって、正確ガードネレラ膣 、一部の女性では膣の微生物群集の重要なメンバーは、キャプチャします。あるいは、338F / 806Rプライマー対は、正常膣サンプル14及び515F / 926Rプライマー対はRECEを有するのパイロシーケンシングのために使用されていますntly次世代シーケンス12のために利用できるようになります。 最後に、このプロトコルは、微生物生態学（QIIME）ソフトウェアパッケージ15に定量的洞察を使用して、16Sアンプリコンの分析を実行するための基本的な手順を説明します。ここで説明するQIIMEコマンドの実装を成功させるには、各サンプルの細菌分類学上の存在量を含むテーブルを生成します。 QIIMEウェブサイト（http://qiime.org/index.html）に詳細に記載されるように多くの付加的な品質管理工程、分類学的分類方法、及び分析ステップは、分析に組み込むことができます。分析は、Appleコンピュータ上で実行する場合は、MacQIIMEパッケージ16は QIIMEとその依存関係の簡単なインストールを提供します。 16S rRNAの遺伝子配列解析のための代替ソフトウェアパッケージはMothur 17とUPARSE 18が含まれます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Any other DNA quantification method will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq or HiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catch-All Sample Collection swab</td>
			<td>Epibio</td>
			<td>QEC89100</td>
			<td>Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELIMINase</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>04-355-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 &#181;m)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw-cap tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.694.006</td>
			<td>For bead beating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 5M NaCl</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24740-011</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl</td>
			<td>Ambion (Invitrogen)</td>
			<td>AM9856</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Ambion (Invitrogen)</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1311-200</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-free distilled water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>Molecular Biology Grade, for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol BioReagent, for molecular biology, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9730</td>
			<td>Warning: Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M Sodium Acetate, pH 5.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9740</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile polystyrene forceps, PS</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-06443-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, clear, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>MoBio</td>
			<td>17000-11</td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7295-0.5mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1492-3900</td>
			<td>Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3121-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X TAE buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X DNA Loading Dye</td>
			<td>Thermo (Fisher)</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50bp GeneRuler Ladder</td>
			<td>Thermo (Fisher)</td>
			<td>SM0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraClean PCR Clean-up Kit</td>
			<td>MoBio</td>
			<td>12500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P11496</td>
			<td>An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515F (forward primer) 5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGAG 
			ATCTACACTATGGTAATTGT 
			GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &#181;M. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded 
			_primers_515F_806R.txt</td>
			<td>IDT is recommended</td>
			<td></td>
			<td>If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 &#956;M. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and 
			_resuspension.doc.&#160; **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read 1 Sequencing Primer 5&#39;-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read 2 Sequencing Primer 5&#39;-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index Sequencing Primer 5&#39;-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3&#39;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td>Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient nucleic acid extraction and 16s rrna gene sequencing for bacterial community characterization

人間の健康と病気の重要な調節因子として微生物群集の役割のための成長の感謝があります。ハイスループットシークエンシング技術は、さまざまなソースからの16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を使用して細菌群集の迅速かつ効率的な特徴付けのために許可されています。 16S rRNA配列の分析のために容易に利用可能なツールは、計算ワークフローを標準化しているが、DNA抽出のための試料処理は、研究間の変動の継続元のままです。ここでは、綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。我々はまた、シーケンシングライブラリーの生成、データ品質管理、および配列分析を含む16S rRNA遺伝子配列決定のための下流の方法を描きます。ワークフローは、解剖学的位置と宿主種の多様から収集した便や綿棒など、複数のサンプルタイプを、対応することができます。また、DNAを回収し、RNAを分離して使用することができます全ゲノムシーケンシングまたはRNA-seqのなど、他のアプリケーションのため。記載された方法は、複数のサンプルのタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、ゲノムメタゲノムおよび転写情報を下流の解析に対応しています。

<html> 16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を使用して、綿棒からの相対的な細菌の存在量の決意を可能にするプロトコルの一般的な概要は、1【選択プロトコルは人間の膣スワブ用に最適化された図に示されているが、簡単にほとんどの粘膜サンプリングサイトに適合させることができます他のホスト。 図2ビーズビーティングプロトコルを用いて単離することができる高品質のDNAとRNAを示す。 図3は、サンプルと各増幅が正しいの単一の強いバンドが得られた12サンプルの成功したPCR増幅を示しますサイズと各水対照バンドが得られなかった。 図4、配列決定前に最終的なライブラリープールの定量化を示している。 図5のシングルエンド300 bpのMiSeqランの後に典型的なシーケンスの品質プロファイルを示します。 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 53939 / 53939fig1.jpg &quot;/&gt; 図1プロトコルの概略概要まず 、核酸は、イソアミルアルコール、フェノール、クロロホルムなどを含む緩衝液中でビーズビーティングによりスワブから抽出されます。 16S rRNA遺伝子の可変領域4は、その後、PCRを用いて得られた核酸から増幅されます。サンプルの数百までからのPCRアンプリコンは、単一の実行に合わせて、配列決定されます。結果のシーケンスは、相対細菌の存在量を決定するための参照データベースに一致しています。プロトコル全体は約3日で実施することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig2.jpg" /> 図2.高品質の核酸抽出は、フェノールを用い：クロロホルムビーズはMを打ちますethod。 （A）DNAの品質、分光光度計を用いて評価しました。 1.8と2.0の間のA260 / A280比は、フェノール又はタンパク質で汚染されていない純粋な核酸を示している。（B）カラムクリーンアップの後、このプロトコルは高品質のRNAを得ることができる、強力な16Sおよび23S rRNAのピークによって示されました。サンプルは採取後（輸送および保管中に）冷たい保たれていない場合（C）RNAの分解が発生する可能性がありますまたはリボヌクレアーゼが処理中に存在している場合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig3.jpg" /> 515Fとバーコード806Rプライマーセットを使用して成功した16S rRNAの遺伝子増幅の図3.確認。トップ ）ゲル電気泳動は、380塩基対の周囲の単一バンドの存在を確認するために使用されるInはテンプレートを用いて増幅したすべてのサンプル。バンドの不在が失敗した増幅を示しています。これが原因で、ヒューマンエラーと繰り返されるべきで、そのサンプルからのPCR反応に通常である。 ボトム ）いいえテンプレート（水）コントロールは、バンドの存在を持つべきではありません同じプライマー対と並行して実行されます。水管理におけるバンドの存在は、汚染された試薬を示しています。そのプライマー対のためのテンプレートや水管理の両方のPCR増幅を汚染し、再実行することができる試薬を廃棄する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig4.jpg" /> 個々の試料のアンプリコンをプールした後、 ライブラリサイズの最終図書館プール濃度および検証の図4.定量。、目最終的なライブラリープールの電子濃度が決定されなければなりません。ライブラリプールはその後さらに2 nMの濃度を達成するために希釈しなければならない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig5.jpg" /> 図5.代表バー読むの各位置でのシーケンス品質スコアのプロット。シーケンスの品質は200塩基対の後にドロップするのは正常ですが、平均品質スコアが30以上に維持する必要があり<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig5large.jpg" target="_blank">、より大きなバージョンを表示するには、こちらをクリックしてください。この図の。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> #SampleID </td><td colspan="2"> バーコード <br/&gt;シーケンス</td><td colspan="3"> LinkerPrimer シーケンス </td><td> rcbcPrimer </td><td> SampleType </td><td> 抽出 バッチ </td><td> 増幅 プレート </td><td> 説明 </td></tr><tr><td> http://qiime.org/_static/Examples/File_：#An例マッピングファイルはで見つけることができます フォーマット/ Example_ マッピング_ FILE.TXT </td><td colspan="2"></td><td colspan="3"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> AG2350 </td><td colspan="2"> TCCCTTGTCTCC </td><td colspan="3"> CCGGACTACHVGGGTWTCTAAT </td><td> rcbc000 </td><td>頸部の 綿棒</td><td> 1 </td><td> A </td><td></td></tr></tbody></table> 表1 のマッピングファイルのテンプレート。クレアティン正確かつ徹底したマッピングファイルが正常にプロトコルを実行するために重要です。マッピングファイルはQIIMEを実行するために必要とされるだけでなく、それはまた、サンプルバーコードとメタデータとの間のリンクを維持するために、任意の体系的バイアス（ 例えば、バッチ間変動）のデータを分析すること、および決定するために研究を可能にしますメタデータと細菌集団の間で興味深い相関関係。ベアボーンマッピング・ファイルが提供されていますが、ユーザーは、可能な限りメタデータを含むなど、多くの列を追加することをお勧めします。膣スワブのための追加のメタデータの例としては、綿棒コレクション、ホルモン避妊薬の種類（該当する場合）、性感染症検査結果などの参加の年齢、日付/時間を含みます<img alt="Suppliment 1" src="/files/ftp_upload/53939/53939suppliment.jpg" /> バーコードリバースプライマー配列 10 の補足ファイル1.一覧 </suP&gt;。最初の3列は、マッピングファイルを完了するために使用することができ、最後の列は目的を注文するため、全プライマー配列を提供しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/Supplemental_Code_File.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

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Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

私たちは、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いて細菌群集の特徴付けのために綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。方法は、複数のサンプルタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、下流分析プロセスの数を収容します。

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

電気鉛フリー、シーケンシャル核酸およびタンパク質の分離

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

3DNAを有する核酸構造の分析と構築

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

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Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

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Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

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Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...