Name: assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining
Uploaded: 2016-04-12T15:00:00
Duration: 6 min 47 s
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हमारा अनुरोध विरोधी Sox3 और विरोधी Myt1 एंटीबॉडी उपलब्ध कराने के लिए क्रमश: बोल्डर में कोलोराडो विश्वविद्यालय में प्रोफेसर माइकल Klymkowsky और मैनचेस्टर विश्वविद्यालय में प्रो नैन्सी Papalopulu धन्यवाद। हम इस प्रोटोकॉल के विकास में उनके व्यावहारिक सुझाव के लिए Papalopulu प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद। इस काम के SZ और जीएल के लिए दो हीलिंग फाउंडेशन Studentships द्वारा समर्थित किया गया था, हीलिंग फाउंडेशन SZ / ईए और जीएल / ईए क्रमश: ईए के लिए वेलकम ट्रस्ट (WT082450MA) से एक कार्यक्रम अनुदान के लिए, और एक संस्थागत सामरिक सहायता अनुदान से दो परियोजना अनुदान वेलकम ट्रस्ट [097820 / Z / 11 / Z] से।

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	<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li><li>Wilson, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-MyT1,+a+Xenopus+C2HC-type+zinc+finger+protein+with+a+regulatory+function+in+neuronal+differentiation.">X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation.</a> Cell. 87, 1191-1202 (1996).</li><li>Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+in+frog+(Xenopus+laevis):+a+marker+for+growing+axons+during+the+embryonic+period.">Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period.</a> J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).</li><li>Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+nervous+system-specific+class+II+beta-tubulin+gene+in+Xenopus+laevis+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).</li><li>Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neurogenesis+in+Xenopus+embryos+regulated+by+a+homologue+of+the+Drosophila+neurogenic+gene+Delta.">Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta.</a> Nature. 375, 761-766 (1995).</li><li>Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+functional+organization+of+spinal+neurons+in+developing+lower+vertebrates.">Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates.</a> Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neurogenesis+in+Xenopus:+the+spatio-temporal+pattern+of+proliferation+and+cell+lineages+in+the+embryonic+spinal+cord.">Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord.</a> Neuron. 3, 399-411 (1989).</li><li>Hirabayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/beta-catenin+pathway+directs+neuronal+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells.">The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells.</a> Development. 131, 2791-2801 (2004).</li><li>Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+identifies+neural+progenitors+in+persistent+neonatal+and+adult+mouse+forebrain+germinative+zones.">Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones.</a> J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).</li><li>Sabherwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apicobasal+polarity+kinase+aPKC+functions+as+a+nuclear+determinant+and+regulates+cell+proliferation+and+fate+during+Xenopus+primary+neurogenesis.">The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis.</a> Development. 136, 2767-2777 (2009).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+expression+of+Pax6+in+Xenopus+forebrain.">Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain.</a> Brain Res. 1239, 92-99 (2008).</li><li>Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Ca2+-binding+protein,+parvalbumin,+during+embryonic+development+of+the+frog,+Xenopus+laevis.">Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis.</a> J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).</li><li>Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xaml1/Runx1+is+required+for+the+specification+of+Rohon-Beard+sensory+neurons+in+Xenopus.">Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus.</a> Dev Biol. 362, 65-75 (2012).</li><li>Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTransgenesis:+a+cross-species,+modular+transgenesis+resource.">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138, 5451-5458 (2011).</li><li>Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+human+SOX3+promoter:+identification+of+transcription+factors+implicated+in+basal+promoter+activity.">Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity.</a> Gene. 344, 287-297 (2005).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myt1+and+Ngn3+form+a+feed-forward+expression+loop+to+promote+endocrine+islet+cell+differentiation.">Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation.</a> Dev Biol. 317, 531-540 (2008).</li><li>Rogers, C. 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लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

यहाँ हम Xenopus भ्रूण में प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस visualizing के लिए एक सुविधाजनक और कुशल विधि का प्रदर्शन। इस विधि तंत्रिका कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार, न्यूरोनल स्टेम कोशिकाओं और विभेदित प्राथमिक न्यूरॉन्स सेल प्रकार विशिष्ट मार्कर का उपयोग कर के आकलन सहित परमिट। प्रोटोकॉल आम तौर पर reproducibility के बहुत ही उच्च स्तर के साथ मजबूत है। भ्रूण कि पूर्व अंडे सेने के चरणों में हैं (यानी अप चरण के लिए 28), हम स्वयं निर्धारण करने से पहले पीतक झिल्ली को हटाने की सिफारिश के रूप में इस भ्रूण को पूरी तरह से निर्धारण से पहले फहरना करने के लिए अनुमति देता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब अपेक्षाकृत प्रारंभिक अवस्था में भ्रूण का संग्रह (सेने से पहले), के बाद से मुड़े भ्रूण बढ़ते कक्ष के अंदर वांछित अभिविन्यास में व्यवस्था करने के लिए बेहद मुश्किल हो जाता है। हम MEMFA या पीएफए ​​निर्धारण इसलिए अतिरिक्त प्रतिजन पुनर्प्राप्ति कदम के बाद प्रतिरक्षाजनकता की हानि का अनुभव नहीं है इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक नहीं है। इसके अलावा, इसimmunostaining प्रक्रिया सीटू संकरण में chromogenic / फ्लोरोसेंट से नमूने में बाहर किया जा सकता है। ऐसे परिदृश्य में, यह बगल में संकरण प्रोटोकॉल के दौरान प्रोटीज कश्मीर उपचार कदम को छोड़ सिफारिश की है। chromogenic / फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट प्रतिक्रिया के बाद, नमूने टीबीएस से धोया और MEMFA / पीएफए ​​तय नमूने के लिए एक समान तरीके से मछली जिलेटिन समाधान में एम्बेड किया जा सकता है। नमूना शीशियों एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर शीशियों यदि सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट बाद में immunofluorescent धुंधला के साथ एक साथ imaged किया जाएगा द्वारा प्रकाश से सुरक्षित किया जा सकता है। कुछ मामलों में, भ्रूण जिलेटिन प्रवेश के बाद जरूरत से ज्यादा हटना सकता है। यह सबसे अधिक संभावना या तो अपर्याप्त निर्धारण या अपर्याप्त टीबीएस ट्राइटन निकासी के कारण होता है। सुनिश्चित करें कि भ्रूण या कम से कम 2-3 घंटे के लिए पीएफए ​​/ MEMFA में तय किया गया है अधिमानतः 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर। समस्या बनी रहती है, 1 घंटे के लिए 3 को बढ़ाने टीबीएस ट्राइटन के समय धुलाई। क्रायो धारा के दौराननिंग, नमूना ब्लॉक की कठोरता भिन्न हो सकते हैं मछली जिलेटिन के रूप में विभिन्न बैचों अलग गुण होते हैं। इस समस्या को आंशिक रूप से microtome का तापमान समायोजन करके मुआवजा दिया जा सकता है। एक कम तापमान एक &quot;कठिन&quot; नमूना ब्लॉक हालांकि अत्यधिक कम तापमान के तहत नमूना ब्लॉक कुरकुरा और इस खंड के लिए मुश्किल हो जाता है में परिणाम होगा। कुछ ठीक ट्यूनिंग या अभ्यास प्रत्येक सेक्शनिंग से पहले (भ्रूण के बिना नकली नमूना ब्लॉकों का उपयोग) लाभकारी विशेष रूप से महत्वपूर्ण नमूनों पर उपयोग करने से पहले हो सकता है। सेक्शनिंग के दौरान एक अधिक सामना करना पड़ा समस्या पतली वर्गों कभी कभी मोटी कांच की प्लेट पर छड़ी करने के बजाय स्टील मंच पर फ्लैट रहने के लिए करते हैं। यह विशेष रूप से बाधा पहुँचा के बाद से यह लगातार निरंतर सेक्शनिंग प्रक्रिया बीच में आता है हो सकता है। खंड कक्ष और (विशेष रूप से) मोटी कांच की प्लेट मशीन और ओ पर काफी ठंडा, या अत्यधिक स्थिर प्रभार नहीं किया जा रहा है: इस तरह के मामलों में आमतौर पर दो कारणों से एक के कारण होता हैperator, विशेष रूप से शुष्क मौसम में। पूर्व नीचे अनुभाग चैम्बर के तापमान मोड़ और अतिरिक्त समय (संभवतः रातोंरात) के लिए भीतर कांच की प्लेट छोड़ने करके हल किया जा सकता है; और ठीक से cryostat ग्राउंडिंग द्वारा उत्तरार्द्ध। एक धातु नल या इसी तरह पानी ट्यूबिंग प्रणाली धातु से बना करने के लिए cryostat की धातु की सतह कनेक्ट स्थिर प्रभार जारी करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका हो सकता है। प्रत्येक उपयोग के बाद, मोटी कांच की थाली, गैर संक्षारक डिटर्जेंट (जैसे तरल dishwashing के रूप में), ultrapure पानी से rinsed के साथ अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए शुद्ध इथेनॉल के साथ छिड़काव किया, और हानिकारक से सतह और किनारों की रक्षा के लिए तौलिया कागज में लिपटे। प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध एंटीबॉडी आम तौर पर विशिष्ट हैं और हम शायद ही कभी अविशिष्ट सोखना या उच्च पृष्ठभूमि संकेत मुठभेड़। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, अवरुद्ध एजेंट, अत्यधिक गर्मी निष्क्रियता (के रूप में सीरम में शराबी तेज़ के गठन के द्वारा कल्पना) के रूप में गर्मी निष्क्रिय बकरी / भेड़ के बच्चे के सीरम का उपयोग करता है, तो चाहिएइस तेज़ रूप में बचा जाना अत्यधिक माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए आकर्षक है और उच्च पृष्ठभूमि का एक स्रोत के लिए योगदान कर सकते हैं। यह संभव है, और कभी कभी, वांछित एक साथ neuronal कोशिकाओं के विभिन्न आबादी कल्पना करने के लिए डबल-धुंधला करने के लिए। ऐसे डबल धुंधला संभव है और आम तौर पर निम्नलिखित संयोजन के साथ संतोषजनक परिणाम देता है: Sox3 / एन-टब या Myt1 / एन-टब। हालांकि, Sox3 और Myt1 की डबल धुंधला तथ्य यह है कि दो एंटीबॉडी खरगोश मूल से दोनों कर रहे हैं से जटिल है। हम संभवतः माध्यमिक एंटीबॉडी से संकेत प्रवर्धन की कमी के कारण, कई एंटीबॉडी प्रत्यक्ष लेबलिंग किट, लेकिन कोई संतोषजनक परिणाम मनाया गया (कम संकेत करने वाली शोर स्तर) का परीक्षण किया है। इस समस्या को नाकाम करने के लिए एक संभव दृष्टिकोण के रूप में नीचे चर्चा की, Xenopus में ट्रांसजेनिक लाइनों को बढ़ाने के लिए किया जाएगा। इस प्रोटोकॉल के मुख्य प्रतिबंध की है कि है, जबकि इस प्रोटोकॉल सकता है पर्याप्त di हैneuronal कोशिकाओं के दो मुख्य पूल stinguish, अर्थात्, Sox3 व्यक्त तंत्रिका स्टेम सेल पूल और Myt1 व्यक्त विभेदित न्यूरॉन्स, यह भेदभाव न्यूरॉन्स के विभिन्न उप आबादी को प्रकट करने की क्षमता का अभाव है। इस तरह के उप आबादी है, जो भी शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स, इन्तेर्नयूरोंस, और संवेदी न्यूरॉन्स, आम तौर पर उनके विभिन्न व्यक्त मार्कर जीन 28-30 की विशेषता है। जैसा कि ऊपर कहा, सीटू Xenopus भ्रूण में एंटीबॉडी आधारित immunofluorescence पहचान पद्धति के साथ संयुक्त संकरण में बहुरंगा के विकास में हाल के अग्रिमों के संभावित जांच के लिए 31 विभेदित न्यूरॉन्स की इन उप आबादी प्रकट करने के अंतराल में भर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, के रूप में चूहों मॉडल में प्रदर्शन किया गया है, यह भी Xenopus में इस तरह के अलग सेल आबादी भेद करने के लिए सेल प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी के एक अधिक व्यापक सेट को बढ़ाने के लिए वांछित किया जाएगा। यह हैयह भी उल्लेख के लायक है कि इस विधि के लिए एक अतिरिक्त के रूप में, इस तरह के multiphoton माइक्रोस्कोपी, 3 डी पुनर्निर्माण, और विभाजन के रूप में ऑप्टिकल इमेजिंग और छवि विश्लेषण में हाल के अग्रिमों, भी के बाद प्रारंभिक आकलन Xenopus oocytes की अधिक व्यापक टिप्पणियों के साथ ही लक्ष्य को हासिल करने के लिए लागू किया जा सकता जल्दी भ्रूण, विशेष रूप से एक जीवित 32,33 स्थापना के अंतर्गत। इसलिए, प्रसार, भेदभाव, और जीवित पशुओं में neuronal कोशिकाओं के आंदोलन को ट्रैक करने के लिए, यह एक या अधिक ट्रांसजेनिक लाइनों है कि सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित फ्लोरोसेंट प्रोटीन बंदरगाह जल्दी Xenopus में इस तरह के सेल आबादी का जीना अवलोकन अनुमति देने के लिए स्थापित करने के लिए वांछित किया जाएगा भ्रूण। एक एक्स की स्थापना न्यूरो विशिष्ट β ट्यूबिलिन प्रमोटर tauGFP और उसके आवेदन ड्राइविंग के साथ laevis लाइन एक अच्छा उदाहरण 23,34 प्रदान की है। दोनों sox3 और myt1 रीढ़ 35-37 में विशेषता से भरा प्रमोटर दृश्यों के साथ, यह श हैअपेक्षाकृत Xenopus में अतिरिक्त ट्रांसजेनिक लाइनों जो दोनों Xenopus सामुदायिक और प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के एक अधिक सामान्य क्षेत्र के लिए बड़े पैमाने पर योगदान देना चाहिए स्थापित करने के लिए आसान हो सकता है ould।

रीढ़ में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास के कई विशिष्ट अभी तक लगातार चरणों शामिल हैं। पहले कदम के तंत्रिका प्रेरण, जब भोली बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं को एक एपिडर्मल भाग्य के बजाय एक तंत्रिका भाग्य की ओर निर्दिष्ट कर रहे है। कई परस्पर विनियामक तंत्र Xenopus और अन्य मॉडल प्रणाली 1,2 में इस चरण के दौरान शामिल कर रहे हैं। इस प्रक्रिया में मुख्य रूप से इस तरह के chordin, नोगिन, और follistatin 3-7 के रूप में अंतर्निहित mesoderm द्वारा उत्पादित secreted कारकों द्वारा समन्वित है। तंत्रिका प्रेरण के बाद, तंत्रिका progenitors के एक सबसेट सेल चक्र से बाहर निकलें और एक प्रक्रिया के रूप में प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस करने के लिए भेजा में अंतर करने के लिए शुरू करते हैं। सभी न्यूरोनल व्यापारियों के इस समय में अंतर नहीं। शेष तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत जिससे स्टेम सेल पूल विकास भर में और वयस्कता में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के निरंतर विकास के लिए आवश्यक बनाए रखने में बढ़ना जारी है। ये जनसंपर्कतंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत oliferating sry (लिंग का पता लगाने क्षेत्र वाई) -box 3 (sox3) जीन 8-11 की उनकी अभिव्यक्ति की विशेषता है। कोशिकाओं के अन्य आबादी है, जो बाहर निकलने के सेल चक्र और एक विभेदित भाग्य के लिए प्रतिबद्ध है, भेदभाव जीन मार्कर, tubulin की अभिव्यक्ति, बीटा द्वारा पहचाने जाते हैं 2 बी वर्ग IIB (tubb2b, एन टब) और माइलिन प्रतिलेखन कारक 1 (myt1) 12-14। इस तरह के अलग-अलग neuronal कोशिकाओं अंततः सहित न्यूरॉन्स की विभिन्न श्रेणियों को जन्म देते हैं, लेकिन करने के लिए, मोटर सीमित नहीं है, अंतर है, और न्यूरल ट्यूब 15-17 के भीतर अलग-अलग क्षेत्रों में तैनात संवेदी न्यूरॉन्स। जबकि महत्वपूर्ण प्रयास नियामक तंत्र है कि patterning और भाग्य पूर्वकाल neuroectoderm में घटनाओं का निर्धारण शासन को उजागर करने के लिए समर्पित कर दिया है, कम ध्यान तंत्रिकाजन्य कि घटनाओं के बाद हो जांच पर किया गया हैप्रारंभिक चरण patterning। दरअसल, संकेत पारगमन, ट्रांसक्रिप्शनल नियमों, साथ ही बाद translational संशोधनों यह सब बाद में मंच में शामिल कर रहे हैं, न्यूरोजेनेसिस 18-20 के दौरान दोनों समय और वंश विनिर्देश को नियंत्रित। इन तंत्रों में आगे की जांच के लिए एक विश्वसनीय विधि की आवश्यकता को आसानी से कल्पना और neuronal कोशिकाओं के विभिन्न आबादी भेद करने के लिए। उपर्युक्त सहित Sox3, Myt1 तंत्रिका मार्कर, और एन टब, इन अलग सेल आबादी की पहचान करने, इस प्रकार neuronal भेदभाव 21-23 की अंतर्निहित तंत्र खुलासा करने के लिए आवश्यक नींव प्रदान करने के लिए एक साधन प्रदान कर सकते हैं। हालांकि न्यूरोनल सेल आबादी के अंतर लेबलिंग अन्य मॉडल जीवों में प्रदर्शन किया गया है, अपेक्षाकृत कुछ अध्ययनों से इस संबंध में अपनी पूरी करने के लिए Xenopus प्रणाली का शोषण किया है। इस संगत एंटीबॉडी के एक कमी है कि मज़बूती से विभिन्न Neur की पहचान करने के लिए मुख्य रूप से की वजह से हैन्यूरल ट्यूब में onal सेल आबादी। यहाँ, हम immunostaining, जो Xenopus में प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस की जांच के लिए एक मजबूत और सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है के माध्यम से जल्दी Xenopus भ्रूण में neuronal भेदभाव visualizing के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल चरण 26 और 45 के बीच मंच Xenopus केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के प्रारंभिक विकास में रुचि शोधकर्ताओं के लिए पर्याप्त मार्गदर्शन देना चाहिए।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1397</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-HCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">793639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MOPS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">RDD003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">37% formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-010K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Freezing Medium (OCT)</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td align="right">14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:71px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gloves</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;85-90&#176;C Heat block</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PAP pen</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetone, analytical grade</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining jar with slide racks</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">anti-acetylated tubulin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;488 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;555 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor&#174; 647 Phalloidin</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

प्रतिनिधि परिणाम विभिन्न स्तरों, अर्थात् अग्रमस्तिष्क, मध्यमस्तिष्क, hindbrain, और रीढ़ की हड्डी, अलग एंटीबॉडी (चित्रा 4) के साथ दाग में मंच 30 Xenopus भ्रूण के पार वर्गों दिखा। के रूप में उल्लेख किया है, Sox3 लेबल जबकि MyT1 लेबल विभेदित प्राथमिक न्यूरॉन्स जावक विस्थापित और न्यूरल ट्यूब के सीमांत परत (बेसल पटल) के पास का पता लगाने न्यूरोनल पूर्वज सेल की आबादी, न्यूरल ट्यूब के लुमेन की निकटता में रेखांकित किया गया। एंटी-एसिटाइल ट्यूबिलिन विभेदित न्यूरॉन्स, जो पूरे न्यूरल ट्यूब के भीतर देखा जा सकता है में एक्सोन लेबल। साइड विशिष्ट जीन पछाड़ना या overexpression तंत्रिका जीव विज्ञान में एक मोटे तौर पर इस्तेमाल किया विधि है कि क्या विशेष जीन (एस) की अभिव्यक्ति नियमन विकास और neuronal कोशिकाओं के भेदभाव को बाधित मूल्यांकन करने के लिए है। ऐसे मामलों में, या तो Morpholinos (राज्यमंत्री) या डीएनए का निर्माण (s) प्रो ले जाने<html> Moter संचालित जीन (एस) के दो सेल चरण 23 से कम दो blastomeres में से एक में इंजेक्ट कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, वे मस्तिष्क वेंट्रिकल electroporation द्वारा पीछा किया, जो पछाड़ना में या अधिक अभिव्यक्ति वांछित जीन (एस) 27 के परिणाम देगा में इंजेक्ट किया जा सकता है। दोनों ही मामलों में, प्रभाव भ्रूण के एक तरफ करने के लिए प्रतिबंधित किया जाएगा, इलाज आंतरिक नियंत्रण के रूप में भ्रूण के विपरीत दिशा में कर रही है। निर्धारण, सेक्शनिंग, और immunostaining के बाद, जीन पछाड़ना / अधिक अभिव्यक्ति के प्रभावों की गिनती और भ्रूण के दोनों किनारों पर विभिन्न आबादी के सेल नंबर की तुलना द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। कई भ्रूण से इन आंकड़ों जमते करके, सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है। हमारे प्रतिनिधि परिणामों में, कोई गड़बड़ी भ्रूण में बनाया गया था। जीन गड़बड़ी और विभिन्न न्यूरोनल सेल आबादी पर उनके प्रभाव के उदाहरण संदर्भों 20,23 में पाया जा सकता है। टी &quot;के लिए: रखने together.within-पेज =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> चित्रा 1:। भ्रूण व्यवस्था और अभिविन्यास खंड सांचे में (ए) एक कार्टून बढ़ते विधानसभा दिखा चित्रण, ध्यान दें ट्रे तारीख, मंच, और भ्रूण के उन्मुखीकरण के साथ चिह्नित किया गया है। (बी) के बढ़ते विधानसभा का प्राकृतिक स्वरूप दिखा एक छवि। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> चित्रा 2:। अभिविन्यास और नमूना पकड़े डिस्क पर जिलेटिन ब्लॉक की स्थिति (ए) धारा ब्लॉक विधानसभा दिखा एक कार्टून चित्रण, ध्यान दें कि भ्रूण एक &quot;ऊपर सिर&quot; की स्थिति में हैं और जिलेटिन ब्लॉक मजबूती ओ तय हो गई हैइस आधार पर ऊतक ठंड माध्यम से नमूना पकड़े डिस्क Nto (देखें चित्र 2 बी)। (बी) धारा ब्लॉक विधानसभा का प्राकृतिक स्वरूप दिखा एक छवि, जिलेटिन ब्लॉक और नमूना पकड़े डिस्क के बीच ऊतक ठंड माध्यम का संचय ध्यान दें। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र तीन" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> चित्रा 3:। सतत सेक्शनिंग (ए) एक खंड कक्ष के मॉडल। नमूना पकड़े डिस्क घुमाया जाना चाहिए और निश्चित स्थिति है कि भ्रूण की ओर का सामना करना पड़ रहा है। कुछ (6-10) वर्गों के बाद, निरंतर अनुभाग टाइल्स की लंबी पट्टी धीरे ब्लेड (नीला) से अलग हो रहे हैं एक ठीक ब्रश का उपयोग कर, और उसके बाद होल्डिंग प्लेट पर 90 डिग्री बदल गया। तो एक कमरा अस्थायी सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड हैमजबूती से नीचे का सामना करना पड़ खंड पट्टी पर दबाया और तुरंत एकत्र समाप्त स्ट्रिप्स को ऊपर उठा लिया। (बी) आम तौर पर, प्रत्येक स्लाइड स्ट्रिप्स के 2 समानांतर लाइनों के रूप में दिखाया जा सकता है। पेंसिल का उपयोग कर स्लाइड लेबल पर विस्तृत रिकॉर्ड बनाने के लिए याद रखें। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> चित्रा 4: चरण 30 एक्स के पार अनुभाग तंत्रिका ऊतक में टैडपोल और धुंधला, 20X। (ए) Schematics Xenopus tadpoles पर की धारा विमानों के सापेक्ष पदों (अग्रमस्तिष्क, मध्यमस्तिष्क, hindbrain, और रीढ़ की हड्डी) का संकेत laevis। (बी) इसी पार वर्गों विरोधी Sox3 (लाल), विरोधी acetylated ट्यूबिलिन (Gree के साथ दागn), और DAPI (नीला), न्यूरल ट्यूब के भीतर तंत्रिका स्टेम सेल पूल के रूप में अच्छी तरह से neurofilaments के रिश्तेदार स्थानों दिखा। (सी) इसी पार वर्गों विरोधी MyT1 (लाल) और DAPI (नीला) के साथ दाग, न्यूरल ट्यूब के भीतर अलग-अलग प्राथमिक न्यूरॉन्स के रिश्तेदार स्थानों दिखा। स्केल बार = 20 माइक्रोन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

यह लेख वर्गों पर immunofluorescent धुंधला का उपयोग Xenopus भ्रूण के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में विभिन्न न्यूरोनल सेल आबादी visualizing के लिए एक सुविधाजनक और तेजी से विधि प्रस्तुत करता है।

आकलन करने में प्राथमिक Neurogenesis<em&gt; Xenopus</em&gt; भ्रूण का उपयोग Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

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से तंत्रिका Explant संस्कृति<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

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में neurodegenerative phenotypes का आकलन<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; घुस Assays के द्वारा डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स और पूरे मस्तिष्क Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

फोकल रेडियोलॉजिकल निषेध के साथ वयस्क Hypothalamic Neurogenesis के कार्यात्मक पूछताछ

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

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परीक्षण दृश्य समारोह में के लिए एक सरल व्यवहार परख<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

माउस प्राथमिक अनुमस्तिष्क granules न्यूरॉन्स में ंयूरॉन मौत और अध कि मॉडलिंग

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

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इमेजिंग तंत्रिका गतिविधि प्राथमिक Somatosensory प्रांतस्था का उपयोग Thy1-GCaMP6s ट्रांसजेनिक चूहों में

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

माउस प्राथमिक हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस में GLUT4 प्रोटीन की तस्करी की लाइव छवियां Deconvolution माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

भ्रूण Neurogenesis के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में माउस Hindbrain

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

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तैयारी और पूरे सेल पैच दबाना के लिए प्रोटोकॉल Xenopus laevis Tectal ंयूरॉंस की रिकॉर्डिंग

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...