Name: assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining
Uploaded: 2016-04-12T15:00:00
Duration: 6 min 47 s
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私たちは親切に、それぞれ、抗Sox3および抗MYT1抗体を提供するためにコロラド大学ボールダー校教授マイケルKlymkowskyとマンチェスター大学で教授ナンシーPapalopuluに感謝します。私たちは、このプロトコルを開発する上で彼らの洞察に満ちた提案をPapalopuluラボのメンバーに感謝します。この作品は、SZとJLには、2つのヒーリング財団Studentships、そ​​れぞれヒーリング財団からSZ / EAおよびJL / EAへの2つのプロジェクト助成金、EAへのウェルカムトラストから一つのプログラムの助成金（WT082450MA）、および1制度の戦略的支援の助成金によってサポートされていましたウェルカム・トラスト[097820 / Z / 11 / Z]から。

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	<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li><li>Wilson, S. 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著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、 アフリカツメガエル胚における一次神経新生を可視化するための便利で効率的な方法を示しています。この方法は、細胞型特異的マーカーを用いて、神経幹細胞および分化した初代ニューロンを含む神経細胞の異なる種類の評価を可能にします。 プロトコルは、再現性の非常に高いレベルで一般的に堅牢です。前孵化段階にある胚（ すなわち 、最大28のステージに）、これは胚が完全に固定する前に、真っすぐになることができますように、我々は手動で固定前に卵黄膜を除去することをお勧めします。 （孵化する前に）比較的早い段階で胚を収集する際に曲がった胚が装着室内部に所望の向きに配置することが極めて困難であるため、これは特に重要です。 MEMFAまたはPFA固定、したがって、追加の抗原回復ステップは、このプロトコルには必要ありません後に我々は、免疫原性の損失を経験していません。また、この免疫染色の手順は、in situハイブリダイゼーション発色/蛍光からのサンプルで実施することができます。このようなシナリオでは、in situハイブリダイゼーションプロトコルの間にプロテアーゼK処理工程を省略することをお勧めします。蛍光/発色基質反応の後、試料を、TBSで洗浄することができ、MEMFA / PFA固定したサンプルと同様に魚ゼラチン溶液に包埋しました。蛍光in situハイブリダイゼーションは、後免疫蛍光染色と一緒に画像化される場合、サンプルバイアルをアルミホイルでバイアルを包むことによって光から保護することができます。 いくつかのケースでは、胚は、ゼラチン浸透後過度に収縮することができます。これは、おそらくどちらかが不十分な固定または不十分なTBS-トリトン抽出によって引き起こされます。胚は4℃で少なくとも2〜3時間、好ましくは一晩PFA / MEMFAで修正されていることを確認してください。問題が解決しない場合は、1時間、3にTBS-トリトンの洗浄時間を増加させます。 クライオ切断面の間に魚ゼラチンの異なるバッチは、異なる特性を有するように寧、サンプルブロックの剛性が変化してもよいです。この問題は、部分的にミクロトームの温度を調整することによって補償することができます。より低い温度は、サンプルブロックがセクションにくっきりと困難になるしかし、過度の低温下で「硬い」のサンプルブロックになります。各切片の前に（胚なしモックサンプルブロックを使用して）いくつかの微調整や練習は、特に貴重なサンプルを上の使用前に有益であり得ます。 切片中に一般的に遭遇する問題は、時々厚のガラス板上に固執するのではなくスチールステージ上に平らに滞在する傾向が薄い部分です。これは、常に連続的な切削プロセスを中断するので、特に破壊することができます。セクション室と（特に）厚のガラス板が機械およびoに十分な寒さ、または過度の静電気されていない。このような例は、通常、二つの理由のいずれかによって引き起こされます特に乾燥した天候でperator、。前者はセクション室の温度を下げ、余分な時間（おそらく一晩）内のガラス板を残すことによって解決することができます。かつ適切クライオスタットを接地することにより、後者。金属タップまたは金属製の同様の水配管システムにクライオスタットの金属面に接続すると、静電気を放出するための代替方法することができます。各使用後、厚いガラス板は、（そのような食器用洗剤など）、非腐食性の洗剤でよく洗浄しなければならない超純水によりリンスし、純粋なエタノールを噴霧し、損傷から表面及びエッジを保護するためにタオル紙に包まれました。 プロトコルに記載された抗体は、一般的に特異的であり、我々はほとんど非特異的吸着または高いバックグラウンドシグナルが発生しません。すべき（血清中のふわふわ沈殿の形成により可視化）、ブロッキング剤としての過度の熱不活性化を熱不活性化ヤギ/子羊血清を使用している場合、ことに留意すべきですこの沈殿剤は、二次抗体に非常に魅力的であり、高いバックグラウンドのソースに貢献するかもしれないとして避けるこ​​と。 ことが可能であり、時には同時に神経細胞の異なる集団を可視化するために二重染色を行うために、所望します。このような二重染色が可能であり、一般的に以下の組み合わせで満足のいく結果が得られます。Sox3 / N-浴槽またはMYT1 / N-浴槽。しかし、Sox3およびMYT1の二重染色は、2つの抗体がウサギの起源からの両方であるという事実によって複雑になります。私たちは、おそらく二次抗体からの信号増幅の不足のために、しかし、満足な結果が観察されなかったいくつかの抗体の直接標識キットを、（低信号対雑音レベル）を試験しています。この問題を回避する1つの可能なアプローチは、以下に説明するように、 アフリカツメガエルにおけるトランスジェニック系統を上げることです。 このプロトコルの主な制限の一つは、このプロトコルは十分にディできるが、ということです神経細胞のstinguish二つの主なプールは、すなわち、Sox3を発現する神経幹細胞プール及びMYT1発現する分化した神経細胞は、分化した神経細胞の異なる亜集団を明らかにする能力を欠きます。含む、しかし、一次運動ニューロン、介在ニューロン、及び感覚ニューロンに限定されるものではなく、そのようなサブ集団は、通常、それらの差次的に発現マーカー遺伝子28-30によって特徴付けられます。上記のように、 アフリカツメガエル胚における抗体ベースの免疫蛍光検出方法と組み合わせてin situハイブリダイゼーション多色の開発における最近の進歩は、潜在的な調査31分化したニューロンのこれらのサブ集団を明らかにするためにギャップを埋めることができます。あるいは、マウスモデルで実証されているように、また、アフリカツメガエルにおいて、異なる細胞集団を区別するために細胞型特異的抗体のより包括的なセットを高めることが望ましいであろう。 それはこのメソッドへの追加として、そのような多光子顕微鏡、3D再構成、およびセグメンテーションなどの光学イメージングおよび画像解析の最近の進歩は、また、 アフリカツメガエル卵母細胞のより包括的な観測を実現するだけでなく、ために初期評価の後に適用することができる、ことを言及も価値があります特に32,33を設定するライブ下の初期胚、。したがって、増殖、分化、および生きた動物における神経細胞の移動を追跡するためには、初期のアフリカツメガエルにおけるこのような細胞集団の生の観察を可能にするために細胞型特異的プロモーターによって駆動される蛍光タンパク質を保有一つ以上のトランスジェニック系統を確立することが望まれるであろう胚。 X.の確立tauGFPとそのアプリケーションを駆動する神経特異的βチューブリンプロモーターとツメガエルのラインが良い例23,34を提供してきました。脊椎動物35-37を特徴sox3とMYT1の両方の完全なプロモーター配列と、それはshのですアフリカツメガエルのコミュニティと一次神経形成研究のより一般的なフィールドの両方に広く貢献すべきであるアフリカツメガエルにおける追加のトランスジェニック系統を確立することは比較的容易であることウルド。

脊椎動物では、中枢神経系の開発は、いくつかの独特まだ連続した段階を含みます。最初のステップは、ナイーブ外胚葉細胞は、神経運命ではなく、表皮の運命に向かって指定されている神経誘導、です。いくつかの相互接続さ調節機構は、 アフリカツメガエルおよび他のモデル系1,2のこの段階の間に関与しています。このプロセスは、主に、コーディン、ノギンおよびフォリスタチン3-7として基本となる中胚葉によって産生される分泌因子によって調整されています。神経誘導した後、神経前駆細胞のサブセットは、細胞周期を終了し、一次神経新生と呼ばれるプロセスで分化し始めます。すべての神経前駆体は、この時点では区別されません。残りの神経前駆細胞は、それによって開発を通して、および成人期に中枢神経系の継続的な成長のために必要な幹細胞のプールを維持し、増殖し続けます。 これらの広報神経前駆細胞をoliferatingはSRY（性決定領域Y）-box 3（sox3）遺伝子8-11の発現によって特徴付けられます。細胞の他の集団、出口細胞周期および分化した運命にコミットするには、分化の遺伝子マーカー、 チューブリン、ベータ2BクラスのIIb（tubb2b、N- 浴槽 ）とミエリン転写因子1（MYT1）の発現により同定されます12-14。このような分化した神経細胞は、最終的には神経管15-17内の異なる領域に位置し、モーター、間、および感覚ニューロンを含むがこれらに限定され、ではないが、ニューロンの異なるカテゴリを生じます。 かなりの努力が前方神経外胚葉でイベントを決定するパターニングと運命を支配する調節機構を解明することに専念してきたが、あまり注目は、以下の発生神経性のイベントを調査してなされたものです初期のパターニング段階。実際に、シグナル伝達、転写の規制だけでなく、翻訳後修飾は、すべての神経新生18-20中の両方のタイミングおよび系統仕様を制御し、この後の段階に関与しています。これらのメカニズムへのさらなる調査が簡単に視覚化し、神経細胞の異なる集団を区別するために信頼性の高い方法を必要とします。 、Sox3、MYT1、及びN-タブを含む上記神経マーカーは、従って、神経分化21-23の基礎となるメカニズムを明らかにするために必要な基礎を提供し、これらの異なる細胞集団を同定するための手段を提供することができます。 神経細胞集団の特異的標識は、他のモデル生物で実証されているが、比較的少数の研究は、この点において最大限にアフリカツメガエル系を利用しています。これは主に、確実に、様々なneurを識別互換性のある抗体の不足に起因しています神経管でonal細胞集団。ここでは、 アフリカツメガエルにおける一次神経発生を調査するための堅牢かつ便利な手法を提供する免疫染色を介して初期のアフリカツメガエル胚で神経分化を可視化する方法について説明します。このプロトコルは、ステージ26とステージ45との間にアフリカツメガエルの中枢神経系の早期開発に興味を持って研究者のための十分な指針を与える必要があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1397</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-HCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">793639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MOPS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">RDD003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">37% formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-010K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Freezing Medium (OCT)</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td align="right">14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:71px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gloves</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;85-90&#176;C Heat block</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PAP pen</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetone, analytical grade</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining jar with slide racks</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">anti-acetylated tubulin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;488 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;555 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor&#174; 647 Phalloidin</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

代表的な結果は、異なる抗体（ 図4）で染色し、異なるレベル、すなわち前脳、中脳、後脳、脊髄、でステージ30 アフリカツメガエル胚の断面を示しています。前述したように、分化した初代神経細胞が外側に移動して、神経管の限界層（基底層）の近くに見つけMYT1標識ながら、神経前駆細胞集団は、神経管の内腔の近くに位置しSox3標識。抗アセチル - チューブリンは、全体の神経管の中に観察することができる分化したニューロンにおける軸索を、ラベルを付けます。 側特異的遺伝子のノックダウンまたは過剰発現は、特定の遺伝子の発現を調節する神経細胞の成長および分化を妨害するかどうかを評価するための神経生物学で広く使用される方法です。このような場合には、モルホリノ（MOS）またはDNA構築物（単数または複数）のいずれかのプロ搬送します<html> moter駆動型遺伝子は、2細胞期23における2つの割球の中に注入されます。あるいは、それらは、ノックダウンまたは過剰発現所望の遺伝子（単数または複数）27の結果となる電気穿孔に続く脳室に注入することができます。どちらの場合も、効果は、未処理の内部コントロールとして、胚の反対側を作り、胚の片側に制限さ​​れます。 固定、切片、および免疫染色した後、遺伝子ノックダウン/過剰発現の影響をカウントし、胚の両側に異なる集団の細胞数を比較することによって定量化されます。いくつかの胚からこれらのデータを蓄積し、統計分析を行うことができます。当社の代表的な結果では、何の摂動は、胚では行いませんでした。遺伝子摂動と異なる神経細胞集団に対する効果の例は、参考文献20,23に記載されています。 トン &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> 図1：セクションの金型における胚の配置及び向き （A）取り付けアセンブリを示す漫画の描写は、トレイは、日付、ステージ、および胚の向きで標識されています注意してください。 （B）取り付けアセンブリの自然な外観を示すイメージ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> 図2：サンプルの保持ディスク上のゼラチンブロックの向きや位置 （A）節ブロックアセンブリを示す漫画の描写、胚は「ヘッドアップ」位置とゼラチンブロックがしっかりと固定されているOであることに注意してください。ベースで組織凍結培地による試料保持ディスクNTO（図2B参照）。 （B）節ブロックアセンブリの自然な外観を示す画像は、ゼラチンブロックと試料保持ディスクとの間の組織凍結培地の蓄積に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> 図3：セクション室の連続切片 （A）のモデル。サンプル保持ディスクは、胚側が上を向いている位置に回転し、固定してください。数（6-10）のセクションの後、連続するセクションのタイルの長いストリップを穏やかに細かいブラシを使用してブレード（青）から分離され、その後、保持板上に90°回転しました。その後、室内温度正に帯電したスライドですしっかりと下に向けセクションストリップに押し付け、すぐに集め、完成ストリップまで上昇。 （b）に示すように、通常は、各スライドは、ストリップの2本の平行線を収容することができます。鉛筆を使用して、スライドラベルに詳細な記録を作成することを忘れないでください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> 図4：ステージ30 X のクロスセクション 神経組織、20Xにオタマジャクシと染色を ツメガエル 。 アフリカツメガエルのオタマジャクシのセクション平面の相対的な位置（前脳、中脳、後脳、脊髄）を示す（A）回路図。 （B）抗Sox3（赤）で染色した断面を対応する、抗アセチル化チューブリン（グリーn）とDAPI（青）、相対的な神経幹細胞プールの位置ならびに神経管内ニューロフィラメントを示します。神経管中で分化した初代ニューロンの相対的な位置を示す抗MYT1（赤）およびDAPI（青）で染色した断面を、対応する（C）。スケールバー=20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

この記事では、切片で免疫蛍光染色を用いて、 アフリカツメガエル胚の中枢神経系における異なる神経細胞集団を可視化するための便利で迅速な方法を提示します。

でプライマリ神経発生を評価します<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚用いた免疫染色

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

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