Name: assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining
Uploaded: 2016-04-12T15:00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining at JoVE.com

Мы благодарим профессора Майкла Klymkowsky в Университете Колорадо в Боулдере и профессор Нэнси Papalopulu в Университете Манчестера за любезно предоставленные анти-Sox3 и анти-Myt1 антител, соответственно. Мы благодарим членов лаборатории Papalopulu за их содержательные предложения в процессе разработки этого протокола. Эта работа была поддержана двумя Healing Foundation Studentships до SZ и JL, два гранта по проекту от врачебного фонда до SZ / EA и JL / ЕА соответственно, грант одной программы из Wellcome Trust в EA (WT082450MA), а также один грант Institutional стратегической поддержки от Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].

<ol>
	<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li><li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+the+development+of+the+forebrain.">Early steps in the development of the forebrain.</a> Dev Cell. 6, 167-181 (2004).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+embryonic+cells+will+become+nerve+cells+unless+told+otherwise.">Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise.</a> Cell. 88, 13-17 (1997).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+activin+receptor+signaling+promotes+neuralization+in+Xenopus.">Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus.</a> Cell. 77, 273-281 (1994).</li><li>Fainsod, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsalizing+and+neural+inducing+gene+follistatin+is+an+antagonist+of+BMP-4.">The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4.</a> Mech Dev. 63, 39-50 (1997).</li><li>Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsoventral+patterning+in+Xenopus:+inhibition+of+ventral+signals+by+direct+binding+of+chordin+to+BMP-4.">Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4.</a> Cell. 86, 589-598 (1996).</li><li>Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spemann+organizer+signal+noggin+binds+and+inactivates+bone+morphogenetic+protein+4.">The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4.</a> Cell. 86, 599-606 (1996).</li><li>Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+Sox3+gene+expressed+in+oocytes+of+early+stages.">The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages.</a> Gene. 188, 101-107 (1997).</li><li>Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Sox3+activates+sox2+and+geminin+and+indirectly+represses+Xvent2+expression+to+induce+neural+progenitor+formation+at+the+expense+of+non-neural+ectodermal+derivatives.">Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives.</a> Mech Dev. 126, 42-55 (2009).</li><li>Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/VegT-regulated+early+zygotic+gene+Xnr5+is+a+direct+target+of+SOX3+regulation.">The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation.</a> Development. 130, 5609-5624 (2003).</li><li>Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+early+embryonic+expression+of+a+neural+specific+transcription+factor+xSOX3+in+Xenopus+laevis.">Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis.</a> Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).</li><li>Bellefroid, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-MyT1,+a+Xenopus+C2HC-type+zinc+finger+protein+with+a+regulatory+function+in+neuronal+differentiation.">X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation.</a> Cell. 87, 1191-1202 (1996).</li><li>Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+in+frog+(Xenopus+laevis):+a+marker+for+growing+axons+during+the+embryonic+period.">Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period.</a> J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).</li><li>Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+nervous+system-specific+class+II+beta-tubulin+gene+in+Xenopus+laevis+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).</li><li>Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neurogenesis+in+Xenopus+embryos+regulated+by+a+homologue+of+the+Drosophila+neurogenic+gene+Delta.">Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta.</a> Nature. 375, 761-766 (1995).</li><li>Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+functional+organization+of+spinal+neurons+in+developing+lower+vertebrates.">Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates.</a> Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neurogenesis+in+Xenopus:+the+spatio-temporal+pattern+of+proliferation+and+cell+lineages+in+the+embryonic+spinal+cord.">Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord.</a> Neuron. 3, 399-411 (1989).</li><li>Hirabayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/beta-catenin+pathway+directs+neuronal+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells.">The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells.</a> Development. 131, 2791-2801 (2004).</li><li>Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+neuronal+differentiation+of+cortical+intermediate+progenitors.">Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors.</a> J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).</li><li>Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+Modulates+Hes1+ultradian+oscillations+by+forming+a+double-negative+feedback+loop.">MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop.</a> Cell Rep. 2, 10-18 (2012).</li><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis.">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev Cell. 20, 19-32 (2011).</li><li>Munoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2/3+expressing+cells.">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Dev Biol. , (2015).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fezf2+promotes+neuronal+differentiation+through+localised+activation+of+Wnt/beta-catenin+signalling+during+forebrain+development.">Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development.</a> Development. 141, 4794-4805 (2014).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signalling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis.">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PloS one. 8, e79469 (2013).</li><li>Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+identifies+neural+progenitors+in+persistent+neonatal+and+adult+mouse+forebrain+germinative+zones.">Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones.</a> J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).</li><li>Sabherwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apicobasal+polarity+kinase+aPKC+functions+as+a+nuclear+determinant+and+regulates+cell+proliferation+and+fate+during+Xenopus+primary+neurogenesis.">The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis.</a> Development. 136, 2767-2777 (2009).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+expression+of+Pax6+in+Xenopus+forebrain.">Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain.</a> Brain Res. 1239, 92-99 (2008).</li><li>Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Ca2+-binding+protein,+parvalbumin,+during+embryonic+development+of+the+frog,+Xenopus+laevis.">Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis.</a> J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).</li><li>Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xaml1/Runx1+is+required+for+the+specification+of+Rohon-Beard+sensory+neurons+in+Xenopus.">Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus.</a> Dev Biol. 362, 65-75 (2012).</li><li>Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+mRNA+hybridization+(FISH)+on+whole+mounts+and+sections.">Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections.</a> Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).</li><li>Canaria, C. A., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+optical+imaging+in+living+embryos.">Advanced optical imaging in living embryos.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).</li><li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research.">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTransgenesis:+a+cross-species,+modular+transgenesis+resource.">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138, 5451-5458 (2011).</li><li>Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+human+SOX3+promoter:+identification+of+transcription+factors+implicated+in+basal+promoter+activity.">Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity.</a> Gene. 344, 287-297 (2005).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myt1+and+Ngn3+form+a+feed-forward+expression+loop+to+promote+endocrine+islet+cell+differentiation.">Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation.</a> Dev Biol. 317, 531-540 (2008).</li><li>Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+is+maintained+by+FGF+signaling+and+restricted+to+the+neural+plate+by+Vent+proteins+in+the+Xenopus+embryo.">Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo.</a> Dev Biol. , 307-319 (2008).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Здесь мы показываем , удобный и эффективный способ визуализации первичного нейрогенеза в Xenopus эмбрионов. Этот метод позволяет производить оценку различных типов нейронных клеток, в том числе нейрональных стволовых клеток и дифференцированных первичных нейронах с использованием маркеров типоспецифические клеток. Протокол, как правило, прочный с очень высоким уровнем воспроизводимости. Для получения эмбрионов , которые находятся на предварительно вылупления стадии (т.е. до стадии 28), мы рекомендуем вручную удалить желточной оболочки до фиксации , поскольку это позволяет эмбрионы полностью выпрямите перед тем фиксации. Это особенно важно при сборе эмбрионов на относительно ранней стадии (до вылупления), так как согнутые эмбрионы чрезвычайно трудно организовать в нужной ориентации внутри монтажной камеры. Мы не испытали потерю иммуногенности после MEMFA или PFA фиксации, следовательно, дополнительной стадии поискового антигена не является необходимым для этого протокола. Кроме того, этотиммунным процедура может быть проведена в образцах из хромогенного / Флуоресцентный в гибридизация. В таком случае рекомендуется, чтобы пропустить протеазы K этап обработки во время на месте протокол гибридизации. После того, как хромогенный / люминесцентная реакции субстрата, образцы могут быть смыты с TBS и заливали в растворе желатина рыбы подобным способом к MEMFA / PFA фиксированных образцов. Примеры Флаконы могут быть защищены от света, обернув флаконов в алюминиевой фольги, если флуоресцентная гибридизация будут отображены вместе с иммунофлуоресцентного окрашивания позже. В некоторых случаях, эмбрионы могут сжиматься чрезмерно после проникновения желатина. Это, скорее всего, вызвано либо недостаточной фиксации или недостаточной экстракции TBS-тритон. Убедитесь, что эмбрионы были зафиксированы в PFA / MEMFA в течение по меньшей мере 2-3 ч, или предпочтительно в течение ночи при температуре 4 ° С. Если проблема не устранена, увеличьте время моющей TBS-Тритона до 3 в течение 1 ч. Во время крио-Sectioнин, жесткость образца блока может изменяться в разные партии рыбьего желатина обладают различными свойствами. Эта проблема может быть частично компенсированы путем регулирования температуры микротома. Более низкая температура приведет к более &quot;жесткой&quot; образец блока, однако при чрезмерном низкой температуре образец блок становится четким и трудно раздел. Некоторые из тонкой настройки или практики (с использованием фиктивных блоков выборки без эмбрионов) перед каждым секционирования может быть полезным перед использованием на особо ценные образцы. Часто встречающимся проблемой во время секционирования является тонкие секции иногда имеют тенденцию придерживаться на толстую стеклянную пластину, а не остаются плоскими на сцене стали. Это может быть особенно срыве, так как он постоянно прерывает непрерывный процесс секционирования. Такие случаи, как правило, вызваны одной из двух причин: секция камеры и (особенно) толщиной стеклянная пластина не достаточно холодно, или слишком статический заряд на машины и оperator, особенно в сухую погоду. Первый может быть решена путем поворота вниз температуру секции камеры и оставляя стеклянную пластину в течение дополнительного времени (возможно, в течение ночи); а вторые правильно заземлении криостат. Подключение к металлической поверхности криостата к металлической водопроводной или аналогичной системы воды трубки из металла может быть альтернативный способ освободить статические заряды. После каждого использования, толстая стеклянная пластина должна быть тщательно промывают неагрессивных моющих средств (например, жидкость для мытья посуды), промывать сверхчистой водой, опрыскивают чистым этанолом, и завернутый в полотенце бумаги для защиты поверхности и кромок от повреждений. Антитела, перечисленные в протоколе, как правило, конкретными и мы редко сталкиваемся неспецифической адсорбции или высокий фоновый сигнал. Следует отметить, что, при использовании инактивированной нагреванием коза / баранина сыворотки в качестве блокирующего агента, чрезмерное тепло-инактивацию (в качестве визуализированы образованием рыхлого осадка в сыворотке) должнаследует избегать, поскольку это осадителем является весьма привлекательным для вторичных антител, и может вносить вклад в источник высокого фона. Можно, а иногда и желательно, чтобы выполнить двойное окрашивание для визуализации различных популяций нервных клеток одновременно. Такое двойное окрашивание возможно и в целом дает удовлетворительные результаты при следующих комбинациях: Sox3 / N-ванна или Myt1 / N-ванна. Тем не менее, дважды окрашивание Sox3 и Myt1 осложняется тем фактом, что оба антитела оба из кроличьего происхождения. Мы проверили несколько антител прямые комплекты маркировки, однако не наблюдалось никаких удовлетворительных результатов (низкий сигнал-шум уровня), возможно, из-за отсутствия усиления сигнала от вторичных антител. Одним из возможных подходов , чтобы обойти эту проблему , было бы поднимать трансгенных линий в ооцитах Xenopus, как описано ниже. Одним из основных ограничений этого протокола является то, что, в то время как этот протокол может достаточно диstinguish два основных пулов нервных клеток, а именно Sox3 экспрессирующих нейронные пул стволовых клеток и Myt1-выражающие дифференцированные нейроны, ему не хватает способности выявить различные субпопуляции дифференцированных нейронов. Такие субпопуляции, которые в том числе, но не ограничиваются ими, первичные моторные нейроны, интернейроны и сенсорные нейроны, как правило , характеризуются их дифференциально экспрессируется маркерных генов 28-30. Как уже упоминалось выше, последние достижения в развитии многоцветной гибридизация в сочетании с антителами на основе метода обнаружения иммунофлюоресценции в Xenopus эмбрионов в может заполнить пробел , чтобы выявить эти субпопуляции дифференцированных нейронов для потенциального расследования 31. В качестве альтернативы, как это было продемонстрировано в модели мышей, было бы также быть желательно , чтобы поднять более полный набор антител типа специфических клеток различать такие разные клеточные популяции в Xenopus. этоСтоит также отметить , что, как дополнение к этому методу, последние достижения в области оптических изображений и анализа изображений, такие как многофотонной микроскопии, 3D - реконструкции и сегментации, также могут быть применены после того, как первоначальные оценки для достижения более комплексных наблюдений в Xenopus ооцитах, а также ранних эмбрионов, особенно при живой обстановке 32,33. Таким образом, для отслеживания пролиферации, дифференцировки и перемещение нейрональных клеток в живых животных, было бы желательно , чтобы создать один или более трансгенных линий , которые укрывают флуоресцентные белки движимый промотора типоспецифичной клеток , чтобы позволить живое наблюдение таких клеточных популяций в начале Xenopus эмбрионов. Создание X. Laevis линия с нейро-специфический β-тубулина промотор , запускающий tauGFP и его приложения обеспечили хороший пример 23,34. С полной последовательности промотора обоих sox3 и myt1 у позвоночных характеризуется 35-37, то шульд быть относительно легко установить дополнительные трансгенные линии в Xenopus , которые должны способствовать обширно как к сообществу Xenopus и более общей области первичного исследования нейрогенеза.

У позвоночных развитие центральной нервной системы включает в себя несколько отличительных еще последовательных этапов. Первым шагом является нейронная индукция, когда наивные эктодермальные клетки определяются по отношению к нейронной судьбы, а не эпидермальной судьбы. Несколько взаимосвязанных регуляторных механизмов вовлечены во время этой стадии в Xenopus и других модельных системах 1,2. Этот процесс в основном координируется секретируемых факторов , продуцируемых нижележащей мезодермы, таких как Chordin, башке и фоллистатина 3-7. После индукции нервной, подмножеством нервных клеток-предшественников выходят из клеточного цикла и начинают дифференцироваться в процесс называется первичным нейрогенеза. Не все нейрональные предшественники дифференцироваться в это время. Остальные нервные клетки-предшественники продолжают разрастаться, тем самым поддерживая пул стволовых клеток, необходимых для дальнейшего роста центральной нервной системы на протяжении развития и во взрослую жизнь. Эти прoliferating нейронных клеток - предшественников , характеризуются их экспрессии SRY (пол определения область Y) -Box 3 (sox3) гена 8-11. Другая популяция клеток, которые выходят из клеточного цикла и совершить дифференцированной судьбы, определяются по экспрессии маркеров генов дифференцировки, тубулина, бета - 2B Класс IIb (tubb2b, N-ванна) и миелин транскрипционный фактор 1 (myt1) 12-14. Такие дифференцированные нервные клетки в конечном счете , приводят к различным категориям нейронов , включая, но не ограничиваясь этим, мотор, меж- и сенсорные нейроны , расположенные в различных областях в пределах нервной трубки 15-17. Несмотря на значительные усилия были посвящены выявлению регуляторных механизмов, которые регулируют структурирование и судьбу определения событий в передней нейроэктодерме, меньше внимания было сделано по расследованию нейрогенные событий, которые происходят вслед заНачальный этап формирования рисунка. Действительно, передача сигнала, транскрипционные правила, а также пост-трансляционной модификации все вовлечены в этой поздней стадии, контролируя как временную , так и во время спецификации клонов нейрогенеза 18-20. Дальнейшие исследования этих механизмов требуется надежный способ легко визуализировать и различать различные популяции нервных клеток. Вышеупомянутый нейронных маркеров, в том числе, Sox3, Myt1, и N-ванна, может служить средством для идентификации этих различных клеточных популяций, обеспечивая тем самым необходимые основы для выявления основных механизмов нейрональной дифференцировки 21-23. Хотя дифференциальная маркировка популяций нейронов клеток были продемонстрированы в других модельных организмах, относительно мало исследований использовал систему Xenopus в ее полноте в этой связи. Это происходит главным образом из-за скудности совместимых антител, которые надежно идентифицировать различные Neurпопуляции диагональных клеток в нервной трубки. Здесь мы опишем метод визуализации дифференцировку нейронов у ранних эмбрионов Xenopus с помощью иммунологического окрашивания, которая обеспечивает надежный и удобный подход для исследования первичного нейрогенеза в Xenopus. Этот протокол должен дать достаточное руководство для исследователей , заинтересованных в раннем развитии Xenopus центральной нервной системы между стадией 26 и стадии 45.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1397</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-HCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">793639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MOPS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">RDD003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">37% formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-010K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Freezing Medium (OCT)</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td align="right">14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:71px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gloves</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;85-90&#176;C Heat block</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PAP pen</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetone, analytical grade</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining jar with slide racks</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">anti-acetylated tubulin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;488 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;555 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor&#174; 647 Phalloidin</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Представительные результаты показывают поперечные сечения стадии 30 Xenopus эмбрионов на разных уровнях, а именно, передний мозг, средний мозг, задний мозг и спинной мозг, окрашивали различными антителами (рисунок 4). Как уже упоминалось, Sox3 меченных нейрональной популяции клеток-предшественников определяет местоположение в непосредственной близости от просвета нервной трубки, в то время как MyT1 меченных дифференцированные первичные нейроны мигрируют наружу и расположены рядом с маргинальным слоем (базальной мембраны) нервной трубки. Анти-ацетил-тубулина этикетки аксоны в дифференцированных нейронов, которые могут наблюдаться в течение всей нервной трубки. Побочное специфический ген нокдаун или избыточная экспрессия является широко используемый метод в области нейробиологии для оценки того, приводит к нарушению роста и дифференцировки нейрональных клеток модуляции экспрессии специфического гена (ов). В таких случаях, либо Morpholinos (MOS) или конструкт (ы) ДНК, несущий про<html> Moter управляемый ген (ы) вводят в одну из двух бластомеров на двуклеточной этапе 23. В качестве альтернативы, они могут быть введены в желудочек головного мозга с последующим электропорация, что приведет к нокдаун или избыточная экспрессия желаемого гена (ов) 27. В обоих случаях последствия будут ограничены одной стороне эмбриона, что делает противоположную сторону эмбриона как необработанное внутреннего контроля. После фиксации, секционирование и иммунное окрашивание, воздействие гена бросовой / сверхэкспрессии количественно путем подсчета и сравнения количества клеток различных популяций на обеих сторонах эмбриона. Накапливая эти данные из нескольких эмбрионов, статистический анализ может быть проведен. В наших репрезентативных результатов не возмущение не было сделано в эмбрионах. Примеры генов возмущения и их влияния на различные популяции нейронов клеток можно найти в ссылках 20,23. т &quot;ВОК: Keep-together.within-страница =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> Рисунок 1:. Эмбрион расположение и ориентация в сечении формы (А) Мультфильм изображение , показывающее монтажную сборку, обратите внимание , что лоток был помечен датой, стадии и ориентации эмбрионов. (B) Изображение , показывая естественный внешний вид монтажного узла. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> Рис . 2: Ориентация и положение желатина блока на удерживающей образец диска (A) Мультфильм изображение , показывающее сборку секции блока, обратите внимание , что эмбрионы находятся в положении «головы вверх» и желатин блок надежно закреплен ONto образца удерживающего диска в зависимости от ткани незамерзающей среды в основании (см Фигура 2В). (Б) изображение , показывающее естественный внешний вид секции узла блока, обратите внимание на накопление ткани незамерзающей среды между блоком желатина и образец удерживающего диска. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> Рис . 3: Непрерывный секционирования (A) Модель секции камеры. Холдинг диск образец должен быть повернут и закреплен на той позиции, что сторона эмбриона была обращена вверх. Через несколько (6-10) секций, длинная полоса непрерывных секций плитки аккуратно отделяется от лезвия (синий) с помощью тонкой кисти, а затем поворачивается на 90 ° на пластине держателя. Тогда комнатной температуры положительно заряженный слайдплотно прижимают к секции полосы лицевой стороной вниз и сразу же поднял до собранных готовых полос. (Б) Как правило, каждый слайд может разместиться 2 параллельные линии полос, как показано на рисунке. Не забывайте делать подробные записи на этикетке слайд с помощью карандаша. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> Рисунок 4: Поперечное сечение ступени 30 X. Laevis головастиков и окрашивание в нервной ткани, 20Х. (А) Schematics , указывающие на относительные положения (передний мозг, средний мозг, задний мозг и спинной мозг) раздела плоскостей на Xenopus головастиков. (B) Соответствующие сечения окрашивали анти-Sox3 (красный), анти-ацетилированный-тубулина (Greeп) и DAPI (синий), показывающий относительное расположение нервных пулов стволовых клеток, а также нейрофиламентов внутри нервной трубки. (C) Соответствующие сечения окрашивали анти-MyT1 (красный) и DAPI (синий), показывающие относительное расположение дифференцированных первичных нейронов в пределах нервной трубки. Шкала бар = 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining at JoVE.com

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Данная статья представляет собой удобный и быстрый способ для визуализации различных популяций клеток нейронов в центральной нервной системе Xenopus эмбрионов с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания на участках.

Оценка первичного нейрогенеза в<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбрионы Использование Иммунологическое

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Нейронных культур эксплантов от<em&gt; Xenopus Хепориз</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Оценка Нейродегенеративных фенотипов<em&gt; Drosophila</em&gt; Дофаминергических нейронов, забравшись на анализы и полного Иммуноокрашивание мозга

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Функциональная Допрос взрослых гипоталамуса нейрогенеза с Focal радиологической ингибирования

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Простой Поведенческая Анализ для тестирования зрительной функции в<em&gt; Xenopus Laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Моделирования нейронов смерти и дегенерации в мышь первичной мозжечковой гранул нейронов

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging нейронной активности в первичной соматосенсорной коры, с помощью Thy1-GCaMP6s трансгенных мышей

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Изображения в реальном времени GLUT4 белка оборота первичной нейронов гипоталамуса мыши с помощью микроскопии деконволюция

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Задний мозг мыши как модель для изучения эмбриональных нейрогенез

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Препараты и протоколы для всей ячейки патч зажим записи Xenopus laevis тектальный нейронов

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...