Name: methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration
Uploaded: 2016-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.

1. الإبداع تحليل المسار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل البروتين interactome الإدراجات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج البروتينات / الجينات من الاهتمام في جدول مع معرفات من الجينات فريدة من نوعها (ويفضل رموز الجينات وأرقام مع?...

<ol>
	<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>Arora, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+cyclic+nucleotide+signaling:+a+question+of+when,+where,+and+why?.">Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why?.</a> Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).</li><li>Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+the+cAMP-dependent+protein+kinase+during+chemotactic+cell+migration.">Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).</li><li>Lim, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+protein+kinase+A+activation+at+the+leading+edge+of+migrating+cells.">Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).</li><li>Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+protein+kinase+A+activity+during+cell+migration+is+mediated+by+A-kinase+anchoring+protein+AKAP+Lbc.">Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc.</a> J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).</li><li>Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+signals+to+the+Arp2/3+complex.">Integration of signals to the Arp2/3 complex.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+assembly+associated+with+protrusion+and+adhesion+in+cell+migration.">Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration.</a> Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).</li><li>Raftopoulou, M., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Rho+GTPases+lead+the+way.">Cell migration: Rho GTPases lead the way.</a> Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).</li><li>Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+proteins:+regulators+of+the+actin+cytoskeleton+and+cell+migration.">Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).</li><li>Hara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+MRP4+prevents+and+reverses+pulmonary+hypertension+in+mice.">Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice.</a> J Clin Invest. 121 (7), (2011).</li><li>Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+protein+4+(MRP4/ABCC4):+a+versatile+efflux+tra+(7),+2888-289nsporter+for+drugs+and+signalling+molecules.">Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules.</a> Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).</li><li>Cheepala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide+compartmentalization:+contributions+of+phosphodiesterases+and+ATP-binding+cassette+transporters.">Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-drug+resistance+protein+4+(MRP4)-mediated+regulation+of+fibroblast+cell+migration+reflects+a+dichotomous+role+of+intracellular+cyclic+nucleotides.">Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides.</a> J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).</li><li>Popovici, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+heterologous+approaches+to+identify+the+LET-756/FGF+interactome.">Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome.</a> BMC Genomics. 7 (105), (2006).</li><li>Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactome+mapping+suggests+new+mechanistic+details+underlying+Alzheimer's+disease.">Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease.</a> Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+and+actin+play+critical+roles+as+downstream+effectors+in+MRP4-mediated+regulation+of+fibroblast+migration.">PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration.</a> Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).</li><li>Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carnitine+palmitoyltransferase+1A+(CPT1A):+a+transcriptional+target+of+PAX3-FKHR+and+mediates+PAX3-FKHR-dependent+motility+in+alveolar+rhabdomyosarcoma+cells.">Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells.</a> BMC Cancer. 12 (154), (2012).</li><li>Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+reporters+of+protein+kinase+A+activity+reveal+impact+of+substrate+tethering.">Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forster+resonance+energy+transfer+-+an+approach+to+visualize+the+spatiotemporal+regulation+of+macromolecular+complex+formation+and+compartmentalized+cell+signaling.">Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).</li><li>Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+imaging+protein+phosphorylation+in+single+living+cells.">Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells.</a> Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).</li><li>Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+propagation+from+membrane+messengers+to+nuclear+effectors+revealed+by+reporters+of+phosphoinositide+dynamics+and+Akt+activity.">Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).</li><li>Yamaguchi, H., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+actin+cytoskeleton+in+cancer+cell+migration+and+invasion.">Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion.</a> Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).</li><li>Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+migration+during+angiogenesis.">Endothelial cell migration during angiogenesis.</a> Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).</li><li>Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+regulates+migration+of+lung+alveolar+epithelial+cells+through+activation+of+Rac1+and+matrix+metalloproteinase-2.">CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).</li><li>Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+at+a+glance.">Cell migration at a glance.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).</li><li>Zaccolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded,+fluorescent+indicator+for+cyclic+AMP+in+living+cells.">A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells.</a> Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).</li></ol>

Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts...

هجرة الخلية هي عملية متعددة الخطوات المعقدة. وقد أظهرت الدراسات أنه خلال خلايا الهجرة والاستقطاب في البادئة والزائدة الحواف. من خلال الالتزام المصفوفة خارج الخلية، وتنص على حافة الرائدة في الجر ضرورية لخلايا الجسم للمضي قدما. وأخيرا، فإن وراء إطلاق حافة إرفاق ملفات الخلفية واكتمال 1،2 دورة الهجرة. وينظم الاستقطاب خلية للهجرة الخلايا كفاءة من خلال الفصل المكاني من الإشارات بين الخلايا. الخلوية رسل الثانية، مثل المخيم، توسط تجزئة الأحداث يشير اللازمة لضبطها غرامة الاتجاه 3،4 الهجرة الخلية. تراكمات التفضيلية للمخيم والتي تعتمد على مخيم كيناز النشاط PKA على حافة الرائدة تلعب أدوارا رئيسية في الاتجاه خلية الهجرة 5،6. بواسطة phosphorylating GTPases الصغيرة مثل الصلة رأس الركيزة C3 توكسين البوتولينوم (راك) والسيطرة على انقسام الخلايا بروتين 42 homolog أو Cdc42، PKوينشط المتعلقة الأكتين البروتين 2/3 (آرب 2/3) في طليعة والحث على تشكيل أقدام صفاحية 7-9. PKA أيضا phosphorylates وكيلا لمكافحة السد، حفز عائي بروتين فسفوري؛ فسوبروتين (VASP)، وبالتالي ينظم دورات متذبذبة التمديد الغشاء وتراجع 10،11. في الخلايا، وينظم مستويات المخيم ثلاث عمليات رئيسية هي: ط) التوليفية التي محلقة محلقة، والثاني) التحلل بواسطة phosphodiesterases، وج) النقل عن طريق النقل هروب رأس المال بغشاء 3. أدوية المتعددة البروتين المقاومة 4 (MRP4)، وهو عضو في ATP ملزم كاسيت (ABC) أسرة من النقل الغشاء، وظائف باعتبارها الناقل هروب رأس المال الذاتية من النيوكليوتيدات الحلقية. لذلك، يمكن MRP4 تنظيم مستويات مخيم داخل الخلايا والخلوية التي تعتمد على المخيم مما يشير 11-13. لقد أظهرنا سابقا أن في Mrp4 - / - الليفية تحتوي على مستويات أعلى نسبيا من النيوكليوتيدات الحلقية وتهاجر أسرع جompared إلى Mrp4 + / + الخلايا الليفية 14. أبلغنا أيضا تأثير ثنائي الطور من النيوكليوتيدات الحلقية على الهجرة الليفية. وبناء على الدراسات السابقة وتقصي لدينا أن Mrp4 - / - الليفية تحتوي على المخيم أكثر استقطابا أثناء الهجرة، ونحن افترضنا أن هذا القانون بوساطة MRP4 للهجرة الخلايا الليفية هو المخيم التابعة. من أجل فهم آلية المصب، اتخذنا نهج مباشر حتى الآن على المتعدد الأوجه. للتعرف على البروتينات المرتبطة بها وفي التفاعل مع MRP4، نحن immunoprecipitated المجمعات الجزيئات التي تحتوي على MRP4 من خلايا HEK293 التي تعبر عن مدى MRP4. باستخدام مطياف الكتلة، حددنا عدة بروتينات التفاعل MRP4 وتحليل الترابط الخاصة بهم باستخدام الإبداع تحليل المسار (IPA). IPA هو أداة مفيدة لتحليل التفاعلات البروتين البروتين (سواء الهيكلية والوظيفية) واستكشاف مساهماتها في الفسيولوجية والمرضية خاصةالأحداث على أساس الأدب والأدلة التجريبية 15،16. وأشار IPA أن F-الأكتين هو الهدف المصب الرئيسي للMRP4 في سياق الهجرة الخلية حيث المخيم والمركب هي مفتاح الجزيئات مما يشير 17. وقد تأكدت هذه المزيد من البيانات بواسطة المجهر عالية المحتوى. المجهر محتوى عال يمكن التقاط وتحليل سلوكيات الخلية مثل الهجرة خلية في أكثر ملاءمة ودقيقة وعالية الإنتاجية نحو 18 عاما. أظهرت بيانات المجهر عالية المحتوى الذي أثر MRP4 بشأن الهجرة الخلايا الليفية وألغيت تماما على اختلال الهيكل الخلوي الأكتين أو تثبيط PKA 17. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) القائم على استشعار PKA لمراقبة ديناميات PKA في الخلايا المهاجرة في الوقت الحقيقي. تتكون أجهزة الاستشعار كيناز القائم على الحنق عادة من الببتيدات الركيزة الفسفرة محددة يحيط بها CFP وfluorophores YFP 19-21. pmAKAR3 ومحسنة ولياستهدفت mbrane استشعار PKA أساس الحنق الذي يحتوي المصاحب forkhead نطاق 1 (FHA1) وتسلسل PKA الركيزة LRRATLVD 5،22. الفسفرة من pmAKAR3 من قبل PKA زيادات فرعية الحفازة الحنق إشارة بين CFP و YFP 19. الإدراج في مجال الدهن تعديل في استشعار يستهدف لغشاء البلازما لرصد ديناميات PKA، وتحديدا في مقصورة غشاء 23. باستخدام pmAKAR3، أثبتنا أن حافة الرائدة في مجال الهجرة Mrp4 - / - الليفية عرضت النشاط PKA أكثر استقطابا من Mrp4 + / + الخلايا الليفية، والتي زادت بدورها تشكيل الأكتين القشرية على حافة الرائدة في الخلية 17. معا، وأسفرت هذه الأحداث في أفضل الاستقطاب الخلوي وهجرة الخلايا أسرع الاتجاه في غياب MRP4. حددت لدينا نهج محدد ومباشر أهداف المصب الرئيسية للMRP4 ويوفر مهم، ولكن كمامن بعد آلية غير المكتشفة لتنظيم تعتمد-MRP4 للهجرة الخلايا الليفية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11668-027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte Zoom</td>
			<td style="width:324px;">Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well IncuCyte Image-Lock microplates&#160;</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;">4493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>L5288</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H-89</td>
			<td style="width:324px;">Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)</td>
			<td>BML-EI196</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35-mm glass-bottomed dishes&#160;</td>
			<td style="width:324px;">(MatTek Corporation; Ashland, MA)</td>
			<td style="width:187px;">P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">31985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">FRET microscopy system</td>
			<td>Olympus inverted microscope (IX51)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Hamamatsu, Japan</td>
			<td style="width:187px;">ORCA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">SlideBook software 5.5</td>
			<td style="width:324px;">Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ingenuity Pathway Analysis software</td>
			<td>IPA, QIAGEN Redwood City,</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forskolin</td>
			<td>Tocris (Ellisville, MO).&#160;</td>
			<td style="width:187px;">1099</td>
			<td>Stock in100% EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM F-12&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">14025-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Excel</td>
			<td style="width:324px;">Microsoft</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">PBS</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td>R-001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration

أدوية المتعددة المقاومة بروتين 4 (MRP4) هو عضو في الأسرة كاسيت ATP ملزم لنقل غشاء وهو نقل هروب رأس المال الذاتية من النيوكليوتيدات الحلقية. عن طريق تحوير تركيز النوكليوتيدات الحلقية داخل الخلايا، يمكن MRP4 تنظيم العديد من الأحداث الخلوية دوري تعتمد على النوكليوتيدات بما في ذلك الهجرة الخلية. في السابق، أثبتنا أن في غياب MRP4، والخلايا الليفية تحتوي على مستويات أعلى من النيوكليوتيدات الحلقية داخل الخلايا، ويمكن أن تهاجر أسرع. لفهم الآليات الكامنة وراء هذه النتيجة، واعتمدنا نهجا مباشرا بعد متعدد الأوجه. أولا، نحن عزل بروتين المجمعات المتفاعل المحتملة للMRP4 من الإفراط في التعبير نظام خلية MRP4 باستخدام مناعي تليها مطياف الكتلة. بعد تحديد البروتينات فريدة من نوعها في interactome MRP4، نحن تستخدم الإبداع تحليل المسار (IPA) لاستكشاف دور هذه التفاعلات البروتين البروتين في سياق نقل الإشارة. نحن توضيح على بودور tential من بروتين معقد MRP4 في هجرة الخلايا والتعرف F-الأكتين كوسيط رئيسي للتأثير MRP4 على الهجرة الخلية. وأكد هذه الدراسة أيضا دور المخيم والمركب، بوصفها عنصرا رئيسيا في ظاهرة الهجرة. باستخدام المجهر عالية المحتوى، أجرينا فحوصات الخلية الهجرة وأشار إلى أن تأثير MRP4 بشأن الهجرة الخلايا الليفية وألغيت تماما من اختلال الهيكل الخلوي الأكتين أو تثبيط المخيم التي تعتمد كينيز (PKA). لتصور يشير التحويرات في خلية المهاجرة في الوقت الحقيقي، ونحن تستخدم جهاز استشعار القائم على الحنق لقياس النشاط PKA وجدت، وجود نشاط PKA أكثر استقطابا بالقرب من الحافة الأمامية من الهجرة Mrp4 - / - الليفية، مقارنة Mrp4 + / + الخلايا الليفية. وهذا بدوره زيادة تشكيل الأكتين القشرية وزيادته عملية الهجرة. نهجنا يمكن التعرف على البروتينات تعمل المصب إلى MRP4 ويوفر لنا مع علىنظرا لآلية المشاركة في التنظيم تعتمد-MRP4 للهجرة الخلايا الليفية.

لدراسة تأثير MRP4 بشأن الهجرة الخلايا الليفية، استخدمنا فحص التئام الجروح باستخدام عالية المحتوى المجهري 14. وقدمت الجروح دقيقة عن الطبقات الوحيدة متموجة من MEFS معزولة عن أي Mrp4 - / - أو اتخذت Mrp4 + / + الفئران، وصور في 1 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration at JoVE.com

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

MRP4 ينظم العديد من الفعاليات الإشارات التي تعتمد على النوكليوتيدات دوري بما في ذلك دور توضيح مؤخرا في الهجرة الخلية. وصفنا نهج مباشرة، ولكن متعدد الأوجه لكشف أهداف جزيئية المصب MRP4 مما أدى إلى التعرف على interactome MRP4 الفريد الذي يلعب دورا رئيسيا في التنظيم صقل للهجرة الخلايا الليفية.

أساليب لدراسة Mrp4 تحتوي على المجمعات ضخم في تنظيم الخلايا الليفية الهجرة

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

الزرد خلية قرنية إإكسبلنتس لدراسة الهجرة الجماعية خلية وعودة التظهرن في شفاء الجروح الجلدية

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

مستقر وكفاءة التحوير الوراثي للخلايا في الكبار ماوس V-SVZ لتحليل العصبية الخلايا الجذعية الذاتية الحكم والآثار لغير المتمتعة بالحكم الذاتي

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

تعظيم الاستفادة من الفحص الجرح خدش للكشف عن تغيرات في الفئران الوسيطة اللحمية الهجرة الخلية بعد الأضرار التي كتبها القابلة للذوبان استخراج دخان السجائر

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

طرق لفحص الليمفاوية الغدة وHemocytes في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

مضان المجهر المعيشة أو الثابتة والملون على أساس ورقة الخفيفة<em&gt; خنفساء الدقيق الحمراء</em&gt; الأجنة

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

أساليب لدراسة التجديد في ستنتور

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

توجيه نسب إعادة برمجة الماوس الكبار تنتجها الخلايا الليفية لموروث محمر

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

التصور للهجرة الخلية عرضية في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في الميلانوجاستر Drosophila

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...