Name: methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration
Uploaded: 2016-05-19T14:00:00
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This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.

1. Ingenuity Pathway Analysis <ol><li> Hochladen von Protein-Interaktom Dataset <ol><li> Legen Sie die Proteine ​​/ Gene von Interesse in einer Tabelle mit ihrer einzigartigen Gen-IDs (vorzugsweise Gensymbole und Gen-ID-Nummern wie mit massenspektrometrischer Daten erhalten). </li><li> Weisen Sie eine Spalte in der Tabelle für Gene Identifizierungsnummer und eine Spalte für Beobachtungswert (z. B. Falten-Änderung oder p-Wert). Wählen Sie die &#39;enthält Spaltenüberschrift&#39; Option, um die Spalte...

<ol>
	<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. 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Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts...

Die Zellmigration ist ein kompliziertes Mehrstufenverfahren. Studien haben gezeigt, dass sich bei der Migration Zellen polarisiert in Vorder- und Hinterkanten. Durch die Einhaltung der extrazellulären Matrix stellt die Vorderkante die Traktion, die für die Zellkörper nach vorne zu bewegen. Schließlich rundet die Hinterkante Releases Nachläufer und den Migrationszyklus 1,2. Zellpolarisation für eine effiziente Zellmigration wird durch räumliche Trennung von intrazellulären Signal geregelt. Cellular second messenger wie cAMP, vermitteln die Kompartimentierung der Signalereignisse , die für fein abgestimmte Richtungszellmigration 3,4. Bevorzugte Ansammlungen von cAMP und cAMP-abhängige Kinase PKA - Aktivität an der Vorderkante spielen Schlüsselrollen in Richtungszellmigration 5,6. Durch phosphorylating kleinen GTPasen wie Ras-bezogene C3 Botulinumtoxin Substrat (rac) und Zellteilungskontrollprotein 42 Homolog oder Cdc42, PKA aktiviert Aktin-verwandtes Protein 2/3 (Arp 2/3) an der Vorderkante und induziert die Bildung von Lamellipodien 7-9. PKA phosphoryliert auch eine anti-capping agent, stimuliert Vasodilatator Phosphoprotein (VASP), wodurch der 10,11 Schwingungszyklen von Membran Ausfahren und Einziehen steuert. In den Zellen werden die cAMP - Spiegel durch drei wesentliche Prozesse geregelt: i) Synthese von Adenylatcyclase, ii) Abbau durch Phosphodiesterasen, und iii) Transport von membrangebundenen Efflux - Transporter 3. Multidrug resistance protein 4 (MRP4), ein Mitglied der ATP-bindende-Kassette (ABC) Familie von Membrantransportern, Funktionen als endogene Effluxtransporter cyclischer Nucleotide. Daher kann MRP4- intrazellulären cAMP - Spiegel regulieren und cAMP-abhängige zelluläre Signalgebung 13.11. Schneller c enthalten relativ höhere zyklische Nukleotide, Fibroblasten und wandern - / - Wir haben das in MRP4- zuvor gezeigt ,ompared zu MRP4 + / + 14 - Fibroblasten. Wir berichteten auch eine zweiphasige Wirkung zyklischer Nukleotide auf Fibroblasten-Migration. Basierend auf früheren Studien und unsere Feststellung , daß MRP4 - / - Fibroblasten im Verlauf der Migration polarisierter cAMP enthalten, die Hypothese aufgestellt , dass diese MRP4-vermittelte Regulation der Fibroblasten - Migration ist cAMP abhängig. Um den nachgeschalteten Mechanismus zu verstehen, haben wir einen direkten noch mehrdimensionalen Ansatz. Um die Proteine ​​im Zusammenhang und im Zusammenspiel mit MRP4- identifizieren, immunpräzipitierten wir MRP4- enthaltende makromolekulare Komplexe aus HEK293-Zellen, die über MRP4- auszudrücken. Mit Massenspektrometrie identifizierten wir mehrere MRP4--interagierende Proteine ​​und analysiert, um ihre Vernetzung mit Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA ist ein nützliches Werkzeug Protein-Protein-Wechselwirkungen (sowohl strukturelle als auch funktionelle) und erkunden ihre Beiträge insbesondere physiologischen und pathologischen AnalyseEreignisse auf der Grundlage der Literatur und experimentelle Beweise 15,16. IPA zeigte , dass F-Aktin ein Hauptziel von Downstream MRP4 im Rahmen der Zellmigration ist , wo cAMP und cGMP die Schlüssel sind Signalmoleküle 17. Diese Daten wurden weiter bestätigt durch High-Content-Mikroskopie. High-Content - Mikroskopie kann die Zell Verhaltensweisen wie Zellmigration in eine bequemere, präzise und mit hohem Durchsatz 18 Art und Weise zu erfassen und zu analysieren. Die High-Content - Mikroskopie Daten zeigten , dass die Wirkung von MRP4 auf Fibroblasten - Migration vollständig auf Unterbrechung des Actin - Cytoskeletts oder Hemmung von PKA 17 aufgehoben wird. Darüber hinaus haben wir ein Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) -basierte PKA Sensor die PKA Dynamik bei der Migration von Zellen in Echtzeit zu überwachen. FRET-Kinase - Sensoren bestehen meist aus spezifischen Phosphorylierungssubstrat Peptiden flankiert von CFP und YFP Fluorophore 19-21. pmAKAR3 ist eine verbesserte und michmbrane gezielte FRET-basierten PKA - Sensor, der forkhead-assoziierte Domäne 1 (FHA1) und der PKA Substratsequenz LRRATLVD 5,22 enthält. Die Phosphorylierung von pmAKAR3 durch die PKA katalytische Untereinheit erhöht FRET - Signals zwischen CFP und YFP 19. Insertion einer Lipidmodifikation Bereich in den Sensor richtet es an die Plasmamembran für PKA Dynamik überwacht wird , speziell an der Membrankammer 23 auf . Mit pmAKAR3 haben wir gezeigt , dass die Vorderkante MRP4- der Migration - / - Fibroblasten zeigten mehr polarisiert PKA - Aktivität als MRP4- + / + Fibroblasten, was wiederum die kortikalen Aktin Formation 17 an der Zelle Vorderkante erhöht. Zusammen führten diese Ereignisse zu einer besseren zellulären Polarisation und schnellere Richtungszellmigration in Abwesenheit von MRP4-. Unsere spezifischen und direkten Ansatz Schlüssel nachgelagerten Ziele für MRP4- identifiziert und stellt eine wichtige, aber wieaus bislang unerforschten Mechanismus für MRP4--abhängige Regulation von Fibroblasten-Migration.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11668-027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte Zoom</td>
			<td style="width:324px;">Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well IncuCyte Image-Lock microplates&#160;</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;">4493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>L5288</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H-89</td>
			<td style="width:324px;">Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)</td>
			<td>BML-EI196</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35-mm glass-bottomed dishes&#160;</td>
			<td style="width:324px;">(MatTek Corporation; Ashland, MA)</td>
			<td style="width:187px;">P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">31985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">FRET microscopy system</td>
			<td>Olympus inverted microscope (IX51)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Hamamatsu, Japan</td>
			<td style="width:187px;">ORCA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">SlideBook software 5.5</td>
			<td style="width:324px;">Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ingenuity Pathway Analysis software</td>
			<td>IPA, QIAGEN Redwood City,</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forskolin</td>
			<td>Tocris (Ellisville, MO).&#160;</td>
			<td style="width:187px;">1099</td>
			<td>Stock in100% EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM F-12&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">14025-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Excel</td>
			<td style="width:324px;">Microsoft</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">PBS</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td>R-001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4-) ist ein Mitglied der ATP-bindenden Kassette Familie von Membrantransportern und ist ein endogenes Effluxtransporter zyklischer Nukleotide. Durch die Modulation der intrazellulären zyklischen Nukleotid-Konzentration kann MRP4- mehrere zyklische Nukleotid-abhängige zelluläre Ereignisse, einschließlich der Zellmigration regulieren. Zuvor haben wir gezeigt, in der Abwesenheit von MRP4, dass Fibroblastzellen höheren intrazellulären zyklischen Nukleotide enthalten und schneller migrieren können. Um die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Erkenntnis verstehen, nahmen wir einen direkten noch mehrdimensionalen Ansatz. Zunächst isolierten wir potentielle Interacting Protein-Komplexe von MRP4- aus einer MRP4- Überexpression Zellsystem Immunpräzipitation durch Massenspektrometrie gefolgt werden. Nach der Identifizierung einzigartigen Proteine ​​im MRP4 Interaktom verwendeten wir Ingenuity Pathway Analysis (IPA), um die Rolle dieser Protein-Protein-Wechselwirkungen im Rahmen der Signaltransduktion zu untersuchen. Wir erläutert die potential Rolle des MRP4 Proteinkomplex in Zellmigration und identifiziert F-Actin als Hauptmediator der Wirkung von MRP4 auf die Zellmigration. Diese Studie betonte auch die Rolle von cAMP und cGMP als wichtige Akteure in der Migrationsphänomene. Mit High-Content-Mikroskopie, führten wir Zell-Migration-Assays und beobachtet, dass die Wirkung von MRP4- auf Fibroblasten-Migration vollständig durch die Störung des Aktin-Zytoskelett oder Hemmung der cAMP-abhängige Kinase A (PKA) wird abgeschafft. Signalisierungs Modulationen in einem migrierenden Zellen in Echtzeit sichtbar zu machen, haben wir eine FRET-basierten Sensor zur Messung PKA - Aktivität verwendet , und die Anwesenheit von mehr polarisiertem PKA - Aktivität in der Nähe der Vorderkante des wandernden MRP4 gefunden - / - Fibroblasten, im Vergleich zu MRP4 + / + Fibroblasten. Dies wiederum kortikalen Aktin Bildung erhöht und verstärkt den Prozess der Migration. Unser Ansatz ermöglicht die Identifizierung der Proteine ​​stromabwärts MRP4- wirkenden und bietet uns eine überAnsicht des Mechanismus in MRP4-abhängige Regulierung von Fibroblastenmigration beteiligt.

Um die Wirkung von MRP4- auf Fibroblasten - Migration untersuchen, verwendeten wir eine Wundheilungsassay unter Verwendung von High-Content - Mikroskopie 14. Precise Wunden wurden auf konfluenten Monolayern von MEFs hergestellt , isoliert aus entweder MRP4 - / - oder MRP4 + / + Mäusen, und die Bilder wurden in 1 h Intervallen für 24 h entnommen. Wir beobachteten eine höhere Migrationsrate für MRP4- <sup...

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Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

MRP4- regelt verschiedene zyklische Nukleotid-abhängige Signalereignisse einschließlich einer kürzlich aufgeklärte Rolle bei der Zellmigration. Wir beschreiben eine direkte, aber vielschichtigen Ansatz, um die nachgelagerten molekularen Targets von MRP4- zu entwirren bei der Identifizierung eines einzigartigen MRP4- Interaktom führt, die Schlüsselrollen in der fein abgestimmten Regulierung der Fibroblasten-Migration spielt.

Methoden zur Untersuchung MRP4- haltigen Makromolekulare Komplexe in der Verordnung von Fibroblast Migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

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Methoden, um die Lymphdrüsen und Blutzellen zu prüfen, die in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

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Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...