Name: methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration
Uploaded: 2016-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.

1. ניתוח נתיב שנינות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך נתוני החלבון-interactome העלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את החלבונים / גני העניין בגיליון אלקטרוני עם מזהי הגן הייחודיים שלהם (רצוי סימני הגן ומספרים מזהים גנים כפי שנתק?...

<ol>
	<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>Arora, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+cyclic+nucleotide+signaling:+a+question+of+when,+where,+and+why?.">Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why?.</a> Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).</li><li>Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+the+cAMP-dependent+protein+kinase+during+chemotactic+cell+migration.">Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).</li><li>Lim, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+protein+kinase+A+activation+at+the+leading+edge+of+migrating+cells.">Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).</li><li>Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+protein+kinase+A+activity+during+cell+migration+is+mediated+by+A-kinase+anchoring+protein+AKAP+Lbc.">Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc.</a> J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).</li><li>Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+signals+to+the+Arp2/3+complex.">Integration of signals to the Arp2/3 complex.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+assembly+associated+with+protrusion+and+adhesion+in+cell+migration.">Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration.</a> Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).</li><li>Raftopoulou, M., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Rho+GTPases+lead+the+way.">Cell migration: Rho GTPases lead the way.</a> Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).</li><li>Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+proteins:+regulators+of+the+actin+cytoskeleton+and+cell+migration.">Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).</li><li>Hara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+MRP4+prevents+and+reverses+pulmonary+hypertension+in+mice.">Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice.</a> J Clin Invest. 121 (7), (2011).</li><li>Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+protein+4+(MRP4/ABCC4):+a+versatile+efflux+tra+(7),+2888-289nsporter+for+drugs+and+signalling+molecules.">Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules.</a> Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).</li><li>Cheepala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide+compartmentalization:+contributions+of+phosphodiesterases+and+ATP-binding+cassette+transporters.">Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-drug+resistance+protein+4+(MRP4)-mediated+regulation+of+fibroblast+cell+migration+reflects+a+dichotomous+role+of+intracellular+cyclic+nucleotides.">Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides.</a> J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).</li><li>Popovici, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+heterologous+approaches+to+identify+the+LET-756/FGF+interactome.">Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome.</a> BMC Genomics. 7 (105), (2006).</li><li>Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactome+mapping+suggests+new+mechanistic+details+underlying+Alzheimer's+disease.">Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease.</a> Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+and+actin+play+critical+roles+as+downstream+effectors+in+MRP4-mediated+regulation+of+fibroblast+migration.">PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration.</a> Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).</li><li>Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carnitine+palmitoyltransferase+1A+(CPT1A):+a+transcriptional+target+of+PAX3-FKHR+and+mediates+PAX3-FKHR-dependent+motility+in+alveolar+rhabdomyosarcoma+cells.">Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells.</a> BMC Cancer. 12 (154), (2012).</li><li>Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+reporters+of+protein+kinase+A+activity+reveal+impact+of+substrate+tethering.">Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forster+resonance+energy+transfer+-+an+approach+to+visualize+the+spatiotemporal+regulation+of+macromolecular+complex+formation+and+compartmentalized+cell+signaling.">Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).</li><li>Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+imaging+protein+phosphorylation+in+single+living+cells.">Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells.</a> Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).</li><li>Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+propagation+from+membrane+messengers+to+nuclear+effectors+revealed+by+reporters+of+phosphoinositide+dynamics+and+Akt+activity.">Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).</li><li>Yamaguchi, H., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+actin+cytoskeleton+in+cancer+cell+migration+and+invasion.">Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion.</a> Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).</li><li>Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+migration+during+angiogenesis.">Endothelial cell migration during angiogenesis.</a> Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).</li><li>Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+regulates+migration+of+lung+alveolar+epithelial+cells+through+activation+of+Rac1+and+matrix+metalloproteinase-2.">CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).</li><li>Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+at+a+glance.">Cell migration at a glance.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).</li><li>Zaccolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded,+fluorescent+indicator+for+cyclic+AMP+in+living+cells.">A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells.</a> Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).</li></ol>

Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts...

נדידת תאים היא תהליך רב שלבים מסובך. מחקרים הראו כי במהלך תאי הגירה מקוטבים לתוך מובילים ונגררים קצוות. על ידי שמירה על תאי מטריקס, את הקצה המוביל מספק את המתיחה הדרוש לגוף התא להתקדם. לבסוף, משחרר הנגרר לקצה המצורף האחורית ומשלים את 1,2 מחזור ההגירה. קיטוב נייד עבור נדידת תאים יעילה מוסדר על ידי פרדה מרחבית של איתות תאית. שליחים משניים סלולריים, כמו קייטנה, לתווך המידור של אירועי האיתות הנדרשים 3,4 נדידת תאים כיוונית מכוילות. הצטברויות מועדפות של מחנה קינאז התלוי cAMP פעילות PKA בחוד החנית ממלאות תפקידים מרכזיים נדידת תאים כיוונית 5,6. על ידי phosphorylating GTPases הקטן כגון מצע רעלן בוטולינום C3 ראס קשור (RAC) ובקרת חלוקת תא חלבון 42 homolog או Cdc42, PKמפעיל חלבון יקטין הקשורים 2/3 (ארפ 2/3) בחוד החנית ואת הגורם להיווצרות lamellipodia 7-9. PKA גם phosphorylates סוכן אנטי מכסה, vasodilator מגורה phosphoprotein (VASP), ובכך מסדיר את מחזורי תנודתית של רחבת הממברנה הכחשה 10,11. בתאים, רמות cAMP מוסדרות שלושה תהליכים עיקריים: א) סינתזה ידי cyclase adenylate, ii) שפלה ידי phosphodiesterases, ו- III) תחבורת ידי מובילים בזרימת קרום נכנס 3. חלבון 4 התנגדות multidrug (MRP4), חבר קסטת מחייב ATP (ABC) המשפחה של מובילי קרום, מתפקד טרנספורטר בזרימת אנדוגני של נוקלאוטידים מחזורי. לכן, MRP4 יכול לווסת את רמות cAMP תאיות cAMP תלוי הסלולר איתות 11-13. בעבר הראינו כי Mrp4 - / -, פיברובלסטים מכילים רמות גבוהות יחסית של נוקלאוטידים מחזורית ולהעביר ג מהרompared כדי Mrp4 + / + פיברובלסטים 14. גם דיווחנו השפעה בי-פאזית נוקלאוטידים מחזורי על הגירה פיברובלסטים. בהתבסס על מחקרים קודמים קביעתנו כי Mrp4 - / - פיברובלסטים מכילים cAMP מקוטב יותר במהלך הנדידה, שיערנו כי תקנה MRP4 בתיווך זה של הגירה פיברובלסטים הוא cAMP תלויים. על מנת להבין את המנגנון במורד הזרם, לקחנו גישה ישירה עדיין רב פנים. כדי לזהות את החלבונים הקשורים ב הגומלין עם MRP4, אנו immunoprecipitated מתחמי macromolecular המכילים MRP4 מתאי HEK293 כי מעל להביע MRP4. באמצעות ספקטרומטר מסה, זיהינו חלבונים MRP4 אינטראקציה מרובים וניתח הקישוריות שלהם באמצעות ניתוח נתיב שנינות (IPA). IPA הוא כלי שימושי כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים (הן מבניות ותפקודיות) ולחקור תרומתם הפיזיולוגית ופתולוגיים בפרטאירועים על סמך הספרות וראיות ניסיוני 15,16. IPA ציין כי F- יקטין היא מטרה במורד זרם עיקרית של MRP4 בהקשר של נדידת תאים שבו cAMP ו- cGMP הוא המפתח מולקולות איתות 17. נתונים אלה אושרו עוד יותר על ידי מיקרוסקופ גבוה תוכן. מיקרוסקופיה גבוהה תוכן יכול ללכוד ולנתח התנהגויות התא כגון נדידת תאים באופן יותר נוח, מדויק תפוקה גבוהה 18. נתוני מיקרוסקופיה גבוהי תוכן הראו כי השפעת MRP4 על הגירת פיברובלסטים הוא בוטל לחלוטין על שיבוש cytoskeleton יקטין או העיכוב של PKA 17. בנוסף, השתמשנו תהודה העברת אנרגיה פורסטר (סריג) מבוסס חיישן PKA לפקח על הדינמיקה PKA ב תאים נודדים בזמן אמת. חיישנים קינאז מבוסס סריג בדרך כלל מורכבים של פפטידים מצע זירחון הספציפיים המוקפים CFP ו fluorophores YFP 19-21. pmAKAR3 הוא משופר ואותיmbrane ממוקד חיישן PKA מבוסס סריג המכיל הקשורים-forkhead מושלם 1 (FHA1) ואת רצף מצע PKA 5,22 LRRATLVD. זירחון של pmAKAR3 ידי עליות למקטע קטליטי PKA סריג אות בין CFP ו YFP 19. קלטי תחום שינוי שומנים לתוך החיישן שממקדים אליו קרום הפלזמה לניטור דינמיקת PKA, במיוחד על תא קרום 23. שימוש pmAKAR3, הראינו כי את הקצה המוביל של נודדות Mrp4 - / - פיברובלסטים הציג פעילות PKA מקוטבת יותר Mrp4 + / + פיברובלסטים, אשר בתורו הגדיל את ההיווצרות יקטין קליפת המוח בחוד החנית של התא 17. יחד, אירועים אלה גרמו קיטוב הסלולר טוב נדידת תאים כיוונית מהר בהעדר MRP4. הגישה הספציפית וישירה שלנו זיהתה מטרות במורד מפתח עבור MRP4 ומספקת חשוב, אבל כמומנגנון עדיין לא נחקר לרגולצית MRP4 תלוי הגירה פיברובלסטים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11668-027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte Zoom</td>
			<td style="width:324px;">Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well IncuCyte Image-Lock microplates&#160;</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;">4493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>L5288</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H-89</td>
			<td style="width:324px;">Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)</td>
			<td>BML-EI196</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35-mm glass-bottomed dishes&#160;</td>
			<td style="width:324px;">(MatTek Corporation; Ashland, MA)</td>
			<td style="width:187px;">P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">31985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">FRET microscopy system</td>
			<td>Olympus inverted microscope (IX51)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Hamamatsu, Japan</td>
			<td style="width:187px;">ORCA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">SlideBook software 5.5</td>
			<td style="width:324px;">Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ingenuity Pathway Analysis software</td>
			<td>IPA, QIAGEN Redwood City,</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forskolin</td>
			<td>Tocris (Ellisville, MO).&#160;</td>
			<td style="width:187px;">1099</td>
			<td>Stock in100% EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM F-12&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">14025-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Excel</td>
			<td style="width:324px;">Microsoft</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">PBS</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td>R-001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration

Multidrug התנגדות חלבון 4 (MRP4) הוא חבר של המשפחה קלטת ATP-מחייב של מובילי הממברנה הוא טרנספורטר בזרימת אנדוגני של נוקלאוטידים מחזורית. על ידי ויסות ריכוז נוקלאוטיד מחזורי תאי, MRP4 יכול לווסת אירועים הסלולר נוקלאוטיד התלוי מחזוריים מרובים כולל נדידת תאים. בעבר, הראינו כי בהעדר MRP4, תאי פיברובלסטים מכילים רמות גבוהות יותר של נוקלאוטידים מחזורי תאי והוא יכול להעביר מהר יותר. כדי להבין את המנגנונים של ממצא זה, אימצנו גישה ישירה עדיין רב פנים. ראשית, אנחנו מבודדים מתחמי חלבון אינטראקציה הפוטנציאל של MRP4 ממערכת התא MRP4 יתר ביטוי באמצעות immunoprecipitation ואחריו-ספקטרומטריית מסה. לאחר זיהוי חלבונים ייחודיים interactome MRP4, השתמשנו שנינות ניתוח נתיב (IPA) כדי לחקור את התפקיד של אינטראקציות בין חלבונים אלה בהקשר של העברת אותות. אנו הבהרנו את פותפקיד tential של מתחם חלבון MRP4 נדידת תאים ו- F יקטין מזוהה כמתווך עיקרי של השפעת MRP4 על נדידת תאים. מחקר זה גם הדגיש את תפקידה של cAMP ו- cGMP כמו שחקני מפתח תופעות הנדידה. באמצעות מיקרוסקופ גבוהה תוכן, בצענו מבחנים-נדידת תאים ו ציינו כי השפעת MRP4 על הגירת פיברובלסטים הוא בוטל לחלוטין על ידי שיבוש cytoskeleton יקטין או העיכוב של קינאז תלוי cAMP (PKA). כדי להמחיש איתות מודולציות בתא נודד בזמן אמת, השתמשנו חיישן מבוסס סריג למדידת פעילות PKA ומצאנו, בנוכחות פעילות PKA מקוטבת יותר ליד הקצה המוביל של נודדות Mrp4 - / - פיברובלסטים, לעומת Mrp4 + / + פיברובלסטים. זה בתורו עלה היווצרות תקטין קליפת מוח augmented בתהליך של הגירה. הגישה שלנו מאפשרת זיהוי של החלבונים הפועלים במורד MRP4 ומספקת לנו עם מעללאור מנגנון המעורבים בויסות MRP4 תלוי הגירה פיברובלסטים.

כדי לחקור את ההשפעה של MRP4 על הגירה פיברובלסטים, השתמשנו assay ריפוי פצעי ניצול מיקרוסקופיה גבוה תוכן 14. פצעים מדויקים נעשו על משטחים ומחוברים של MEFs המבודד משני Mrp4 - / - או Mrp4 + / + עכברים, ותמונות צולמו 1 במרווחי hr למשך 24...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration at JoVE.com

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

MRP4 מסדיר אירועי איתות נוקלאוטיד תלוי מחזוריים שונים, כולל תפקיד הובהר לאחרונה נדידת תאים. אנו מתארים גישה ישירה, אך רבה לפענח את המטרות המולקולריות במורד הזרם של MRP4 וכתוצאה מכך ההזדהות של interactome MRP4 ייחודי שמנגן תפקידי מפתח בוויסות מכוונת-הקנס של הגירה פיברובלסטים.

שיטות לחקר Mrp4 המכילים מכלולים Macromolecular בחוק הסדרת פיברובלסטים הגירה

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

שיטות המחקר של התחדשות ב- Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית בדרוזופילה מלאנוסטר

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...