Name: methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration
Uploaded: 2016-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.

1.創意工夫パスウェイ解析<ol><li>アップロードタンパク質 - インタラクトームデータセット<ol><li>彼らのユニークな遺伝子識別子（質量分析データで得られたとして、好ましくは、遺伝子記号および遺伝子識別番号）とのスプレッドシートで目的のタンパク質/遺伝子を挿入します。 </li><li>遺伝子識別番号と観測値の1列（ 例えば 、倍数変化またはp値）のためのスプレッドシートの1列...

<ol>
	<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>Arora, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+cyclic+nucleotide+signaling:+a+question+of+when,+where,+and+why?.">Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why?.</a> Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).</li><li>Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+the+cAMP-dependent+protein+kinase+during+chemotactic+cell+migration.">Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).</li><li>Lim, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+protein+kinase+A+activation+at+the+leading+edge+of+migrating+cells.">Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).</li><li>Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+protein+kinase+A+activity+during+cell+migration+is+mediated+by+A-kinase+anchoring+protein+AKAP+Lbc.">Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc.</a> J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).</li><li>Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+signals+to+the+Arp2/3+complex.">Integration of signals to the Arp2/3 complex.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+assembly+associated+with+protrusion+and+adhesion+in+cell+migration.">Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration.</a> Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).</li><li>Raftopoulou, M., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Rho+GTPases+lead+the+way.">Cell migration: Rho GTPases lead the way.</a> Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).</li><li>Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+proteins:+regulators+of+the+actin+cytoskeleton+and+cell+migration.">Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).</li><li>Hara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+MRP4+prevents+and+reverses+pulmonary+hypertension+in+mice.">Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice.</a> J Clin Invest. 121 (7), (2011).</li><li>Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+protein+4+(MRP4/ABCC4):+a+versatile+efflux+tra+(7),+2888-289nsporter+for+drugs+and+signalling+molecules.">Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules.</a> Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).</li><li>Cheepala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide+compartmentalization:+contributions+of+phosphodiesterases+and+ATP-binding+cassette+transporters.">Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-drug+resistance+protein+4+(MRP4)-mediated+regulation+of+fibroblast+cell+migration+reflects+a+dichotomous+role+of+intracellular+cyclic+nucleotides.">Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides.</a> J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).</li><li>Popovici, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+heterologous+approaches+to+identify+the+LET-756/FGF+interactome.">Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome.</a> BMC Genomics. 7 (105), (2006).</li><li>Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactome+mapping+suggests+new+mechanistic+details+underlying+Alzheimer's+disease.">Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease.</a> Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+and+actin+play+critical+roles+as+downstream+effectors+in+MRP4-mediated+regulation+of+fibroblast+migration.">PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration.</a> Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).</li><li>Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carnitine+palmitoyltransferase+1A+(CPT1A):+a+transcriptional+target+of+PAX3-FKHR+and+mediates+PAX3-FKHR-dependent+motility+in+alveolar+rhabdomyosarcoma+cells.">Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells.</a> BMC Cancer. 12 (154), (2012).</li><li>Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+reporters+of+protein+kinase+A+activity+reveal+impact+of+substrate+tethering.">Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forster+resonance+energy+transfer+-+an+approach+to+visualize+the+spatiotemporal+regulation+of+macromolecular+complex+formation+and+compartmentalized+cell+signaling.">Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).</li><li>Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+imaging+protein+phosphorylation+in+single+living+cells.">Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells.</a> Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).</li><li>Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+propagation+from+membrane+messengers+to+nuclear+effectors+revealed+by+reporters+of+phosphoinositide+dynamics+and+Akt+activity.">Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).</li><li>Yamaguchi, H., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+actin+cytoskeleton+in+cancer+cell+migration+and+invasion.">Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion.</a> Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).</li><li>Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+migration+during+angiogenesis.">Endothelial cell migration during angiogenesis.</a> Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).</li><li>Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+regulates+migration+of+lung+alveolar+epithelial+cells+through+activation+of+Rac1+and+matrix+metalloproteinase-2.">CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).</li><li>Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+at+a+glance.">Cell migration at a glance.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).</li><li>Zaccolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded,+fluorescent+indicator+for+cyclic+AMP+in+living+cells.">A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells.</a> Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).</li></ol>

Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts...

細胞移動は、複雑な多段階プロセスです。研究は、移行細胞中に前縁及び後縁に分極されていることを示しています。細胞外マトリックスに付着することで、先端が前方に移動するための細胞体に必要なトラクションを提供します。最後に、エッジのリリースに末尾の後部アタッチメントとは、移行サイクル1,2を完了します。 効率的な細胞移動のための細胞の分極は、細胞内シグナル伝達の空間的な分離によって調節されます。また、cAMPなどの細胞のセカンドメッセンジャー、微調整の方向性細胞遊走3,4に必要なシグナル伝達事象の区画化を媒介します。リーディングエッジでcAMPおよびcAMP依存性キナーゼPKA活性の優先的な蓄積は、方向性細胞遊走5,6において重要な役割を果たしています。このようなRas関連C3ボツリヌス毒素基質（RAC）と細胞分裂制御タンパク質42ホモログまたはCdc42の、PKなどの低分子量GTPaseをリン酸化することにより、Aは、立ち上がりエッジでアクチン関連タンパク質2/3（アープ2/3）を活性化し、葉状仮足7-9の形成を誘導します。 PKAはまた、抗キャッピング剤をリン酸化し、血管拡張剤は、それによって、膜の伸縮10,11の振動周期を調節し、リンタンパク質（VASP）を刺激しました。 膜結合型排出トランスポーター3によって輸送アデニル酸シクラーゼによってI）の合成、ホスホジエステラーゼによってii）の劣化、及びiii）：細胞では、cAMPレベルは、3つの主要なプロセスによって規制されています。多剤耐性タンパク質4（MRP4）、膜輸送体のATP結合カセット（ABC）ファミリーのメンバー、環状ヌクレオチドの内因性の排出トランスポーターとして機能します。したがって、MRP4は11-13シグナル 、細胞内cAMPレベルおよびcAMP依存性細胞を調節することができます。 - / -線維芽細胞は、環状ヌクレオチドの比較的高いレベルを含有し、より速いCを移行我々は以前MRP4であることを示しましたMRP4 + / +線維芽細胞14にompared。我々はまた、線維芽細胞の遊走上の環状ヌクレオチドの二相性の効果を報告しました。以前の研究に基づいており、MRP4がという我々の発見- / -線維芽細胞は、移行の過程でより多くの偏光のcAMPが含まれている、我々は、線維芽細胞の遊走のこのMRP4媒介性調節は、cAMPのが依存しているという仮説を立てました。下流側の機構を理解するために、我々は直接まだ多面的なアプローチを取りました。 関連するとMRP4との相互作用中のタンパク質を同定するために、我々は以上のMRP4を発現するHEK293細胞からMRP4含有高分子複合体を免疫沈降させました。質量分析を使用して、我々は、複数のMRP4相互作用タンパク質を同定し、創意工夫パスウェイ解析（IPA）を使用して、それらの相互接続性を分析しました。 IPAは、（構造的および機能の両方）タンパク質 - タンパク質相互作用を分析し、特定の生理学的および病理学における彼らの貢献を探求するための有用なツールであります文学と実験的証拠15,16に基づいてイベント。 IPAは、F-アクチンは、cAMPおよびcGMPのは、分子17シグナル伝達の鍵となる細胞遊走の文脈におけるMRP4の主要な下流標的であることを示しました。これらのデータはさらに、高含有量顕微鏡により確認しました。高コンテンツ顕微鏡は、より便利で正確かつ高スループットの方法18に、このような細胞遊走などの細胞挙動をキャプチャし、分析することができます。高コンテンツ顕微鏡データは、線維芽細胞の遊走にMRP4の影響を完全にPKA 17のアクチン細胞骨格または阻害の破壊時に廃止されていることを実証しました。 さらに、我々は、リアルタイムでの細胞の移行にPKA動態をモニ​​ターするためにPKAセンサーベースの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用います。 FRETベースのキナーゼセンサーは通常、CFPとYFPの蛍光団19-21によって隣接特異的リン酸化基質ペプチドで構成されています。 pmAKAR3が向上し、私れますmbraneはフォークヘッド関連ドメイン1（FHA1）とPKA基質配列LRRATLVD 5,22が含まれているFRETベースのPKAセンサーをターゲットに。 PKA触媒サブユニットの増加によりpmAKAR3のリン酸化は、CFPとYFP 19との間の信号をFRET。センサーへの脂質修飾ドメインの挿入は、特に、膜区画23において、PKA動態を監視するための原形質膜に標的化します。 pmAKAR3を使用して、我々は実証そのMRP4の移行の前縁- / -今度はセルの前縁17での皮質アクチン形成を増加MRP4 + / +線維芽細胞、より多くの偏PKA活性を示した線維芽細胞。一緒に、これらのイベントは、MRP4の不在下でより良い携帯偏光と速い方向性細胞遊走をもたらしました。当社の特定と直接的なアプローチは、MRP4のための鍵下流標的を同定し、重要なを提供していますが、として線維芽細胞の遊走のMRP4依存性調節のためのまだ未踏のメカニズム。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11668-027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte Zoom</td>
			<td style="width:324px;">Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well IncuCyte Image-Lock microplates&#160;</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;">4493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>L5288</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H-89</td>
			<td style="width:324px;">Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)</td>
			<td>BML-EI196</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35-mm glass-bottomed dishes&#160;</td>
			<td style="width:324px;">(MatTek Corporation; Ashland, MA)</td>
			<td style="width:187px;">P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">31985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">FRET microscopy system</td>
			<td>Olympus inverted microscope (IX51)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Hamamatsu, Japan</td>
			<td style="width:187px;">ORCA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">SlideBook software 5.5</td>
			<td style="width:324px;">Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ingenuity Pathway Analysis software</td>
			<td>IPA, QIAGEN Redwood City,</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forskolin</td>
			<td>Tocris (Ellisville, MO).&#160;</td>
			<td style="width:187px;">1099</td>
			<td>Stock in100% EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM F-12&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">14025-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Excel</td>
			<td style="width:324px;">Microsoft</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">PBS</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td>R-001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration

多剤耐性タンパク質4（MRP4）膜トランスポーターのATP結合カセットファミリーのメンバーであり、環状ヌクレオチドの内因性の排出トランスポーターです。細胞内の環状ヌクレオチド濃度を調節することにより、MRP4は、細胞遊走を含む複数の環状ヌクレオチド依存性細胞事象を調節することができます。以前、我々は、MRP4の非存在下で、線維芽細胞は、細胞内の環状ヌクレオチドのより高いレベルを含有し、より迅速に移行することができることを実証しました。この知見の根底にあるメカニズムを理解するために、我々は直接まだ多面的なアプローチを採用しました。まず、質量分析に続いて免疫沈降法を用いて、MRP4過剰発現細胞系からMRP4の潜在的な相互作用タンパク質複合体を単離しました。 MRP4のインタラクトームに固有のタンパク質を同定した後、我々は、シグナル伝達との関連でこれらのタンパク質 - タンパク質相互作用の役割を探求するために工夫経路分析（IPA）を利用します。私たちは、経口解明しました細胞遊走のMRP4の効果の主要なメディエーターとして細胞移動におけるMRP4タンパク質複合体と同定されたF-アクチンのtential役割。この研究はまた渡り鳥の現象におけるキープレーヤーとしてのcAMPおよびcGMPの役割を強調しました。高含量顕微鏡を用いて、我々は、細胞遊走アッセイを行い、繊維芽細胞の遊走にMRP4の影響を完全にcAMP依存性キナーゼA（PKA）のアクチン細胞骨格又は阻害の破壊によって廃止されることを観察しました。リアルタイムでの移行のセルに変調をシグナリングを可視化するために、我々はPKA活性を測定するためのFRETベースのセンサーを利用し、見つかった、MRP4の移行の前縁近くでより多くの偏PKA活性の存在- / -と比較して、線維芽細胞、MRP4 + / +線維芽細胞。これにより、皮質のアクチン形成を増加し、移行のプロセスを増強しました。我々のアプローチは、MRP4の下流に作用するタンパク質の同定を可能にし、オーバーを提供してくれます線維芽細胞の遊走のMRP4依存性調節に関与する機構の眺め。

線維芽細胞遊走に対するMRP4の影響を研究するために、我々は、高含量の顕微鏡14を用いた創傷治癒アッセイを使用します。正確な創傷から単離されたMEFのコンフルエントな単層上で行われたいずれかのMRP4 - / -またはMRP4 + / +マウス、および画像は24時間を1時間間隔で採取しました。 MRP4 + / +<...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration at JoVE.com

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

MRP4は、細胞遊走における最近明らかに役割を含む種々の環状ヌクレオチド依存性シグナル伝達事象を調節します。我々は、線維芽細胞の遊走の微調整調節に重要な役割を果たしているユニークなMRP4のインタラクトームの識別結果としてMRP4の下流の分子標的を解明するために、直接、しかし、多面的なアプローチについて説明します。

線維芽細胞移動の調節にMRP4含有高分子複合体を研究するための方法

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

ゼブラフィッシュ角膜実質外植片は皮膚創傷治癒における集団細胞の移動および再上皮化を研究するために

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

可溶性タバコの煙抽出物によって損傷した後のマウス間葉系幹細胞の移動の変化を検出するために創傷スクラッチアッセイの最適化

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

リンパ腺や血球中を調べるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

ラッパムシの再生の研究のための方法

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

リネージュの赤芽球系前駆細胞に成体マウス線維芽細胞のリプログラミングを直接します。

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

発展途上ひよこ視蓋接線細胞移動の可視化

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける内分泌破壊を試験する方法

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...