Name: methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration
Uploaded: 2016-05-19T14:00:00
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This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.

1. 독창성 통로 분석 <ol><li> 업로드 단백질 상호 작용 체의 데이터 집합 <ol><li> 자신의 고유 한 유전자 식별자 (질량 분석 데이터를 얻을으로 바람직 유전자 기호 및 유전자 식별 번호)와 스프레드 시트에 대한 관심의 단백질 / 유전자를 삽입합니다. </li><li> 유전자 식별 번호에 대한 스프레드 시트에서 하나의 컬럼과 관측 값에 대한 하나의 컬럼을 지정합니다 (예 :., 접어 변화 또는 p 값). 열...

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	<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>Arora, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+cyclic+nucleotide+signaling:+a+question+of+when,+where,+and+why?.">Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why?.</a> Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).</li><li>Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+the+cAMP-dependent+protein+kinase+during+chemotactic+cell+migration.">Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).</li><li>Lim, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+protein+kinase+A+activation+at+the+leading+edge+of+migrating+cells.">Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).</li><li>Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+protein+kinase+A+activity+during+cell+migration+is+mediated+by+A-kinase+anchoring+protein+AKAP+Lbc.">Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc.</a> J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).</li><li>Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+signals+to+the+Arp2/3+complex.">Integration of signals to the Arp2/3 complex.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+assembly+associated+with+protrusion+and+adhesion+in+cell+migration.">Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration.</a> Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).</li><li>Raftopoulou, M., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Rho+GTPases+lead+the+way.">Cell migration: Rho GTPases lead the way.</a> Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).</li><li>Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+proteins:+regulators+of+the+actin+cytoskeleton+and+cell+migration.">Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).</li><li>Hara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+MRP4+prevents+and+reverses+pulmonary+hypertension+in+mice.">Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice.</a> J Clin Invest. 121 (7), (2011).</li><li>Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+protein+4+(MRP4/ABCC4):+a+versatile+efflux+tra+(7),+2888-289nsporter+for+drugs+and+signalling+molecules.">Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules.</a> Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).</li><li>Cheepala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide+compartmentalization:+contributions+of+phosphodiesterases+and+ATP-binding+cassette+transporters.">Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-drug+resistance+protein+4+(MRP4)-mediated+regulation+of+fibroblast+cell+migration+reflects+a+dichotomous+role+of+intracellular+cyclic+nucleotides.">Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides.</a> J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).</li><li>Popovici, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+heterologous+approaches+to+identify+the+LET-756/FGF+interactome.">Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome.</a> BMC Genomics. 7 (105), (2006).</li><li>Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactome+mapping+suggests+new+mechanistic+details+underlying+Alzheimer's+disease.">Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease.</a> Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+and+actin+play+critical+roles+as+downstream+effectors+in+MRP4-mediated+regulation+of+fibroblast+migration.">PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration.</a> Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).</li><li>Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carnitine+palmitoyltransferase+1A+(CPT1A):+a+transcriptional+target+of+PAX3-FKHR+and+mediates+PAX3-FKHR-dependent+motility+in+alveolar+rhabdomyosarcoma+cells.">Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells.</a> BMC Cancer. 12 (154), (2012).</li><li>Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+reporters+of+protein+kinase+A+activity+reveal+impact+of+substrate+tethering.">Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forster+resonance+energy+transfer+-+an+approach+to+visualize+the+spatiotemporal+regulation+of+macromolecular+complex+formation+and+compartmentalized+cell+signaling.">Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).</li><li>Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+imaging+protein+phosphorylation+in+single+living+cells.">Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells.</a> Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).</li><li>Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+propagation+from+membrane+messengers+to+nuclear+effectors+revealed+by+reporters+of+phosphoinositide+dynamics+and+Akt+activity.">Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).</li><li>Yamaguchi, H., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+actin+cytoskeleton+in+cancer+cell+migration+and+invasion.">Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion.</a> Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).</li><li>Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+migration+during+angiogenesis.">Endothelial cell migration during angiogenesis.</a> Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).</li><li>Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+regulates+migration+of+lung+alveolar+epithelial+cells+through+activation+of+Rac1+and+matrix+metalloproteinase-2.">CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).</li><li>Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+at+a+glance.">Cell migration at a glance.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).</li><li>Zaccolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded,+fluorescent+indicator+for+cyclic+AMP+in+living+cells.">A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells.</a> Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).</li></ol>

Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts...

세포 이동은 복잡한 여러 단계의 프로세스입니다. 연구는 이주 세포 중 선행 및 후행 가장자리에 편광되는 것으로 나타났습니다. 셀 몸이 앞으로 이동하는 세포 외 기질에 부착함으로써, 리딩 엣지가 필요한 견인을 제공합니다. 마지막으로, 가장자리 자료를 후행 후면 첨부 파일 및 마이그레이션주기 1, 2를 완료합니다. 효율적인 세포 이동에 대한 세포 편광은 세포 내 신호의 공간 분리에 의해 조절된다. 이러한 캠프와 같은 셀룰러 두 번째 메신저는 미세 조정 방향 셀 마이그레이션 3,4에 필요한 신호 이벤트의 구획화을 중재. 최첨단 캠프와 캠프에 의존 키나제 PKA 활동의 우선 축적은 방향성 세포 이동 5,6의 핵심 역할을한다. 이러한 라스 관련 C3의 보툴리눔 독소 기판 (RAC) 및 세포 분열 조절 단백질 (42) 동족체 또는 Cdc42, PK 작은 GTP 아제를 인산화함으로써,A는 최첨단 액틴 관련 단백질 2/3 ARP (2/3)를 활성화하고 lamellipodia 7-9의 형성을 유도한다. PKA는 항 - 캡핑 화제 인산화, 혈관을 확장하여 막 신축 10,11의 진동주기를 조절하는, 인 단백질 (VASP)를 자극. 막 - 결합 유출 운송 (3)에 의해 전) 합성 아데 닐 레이트 사이 클라 제, 포스 포에 의해 ⅱ)의 악화, 그리고 ⅲ) 교통으로 : 세포에서 캠프 레벨은 세 가지 주요 프로세스에 의해 조절된다. 다제 내성 단백질 4 (MRP4), 순환 뉴클레오티드의 내생 유출 수송 등의 막 수송, 기능의 ATP 바인딩 카세트 (ABC) 가족의 일원. 따라서, MRP4는 세포 내 캠프 수준을 조절할 수 있으며, 캠프에 의존하는 세포는 11 ~ 13 신호. - / -, 섬유 아세포는 순환 뉴클레오티드의 상대적으로 높은 수준을 포함하고 빠른 C를 마이그레이션 우리는 이전 Mrp4에 있음을 보여 주었다Mrp4 + / + 섬유 아세포 (14)에 ompared. 우리는 또한 섬유 아세포 이전에 주기적 뉴클레오티드의 이상성 효과를보고했다. 이전의 연구에 근거하고 Mrp4는 우리의 발견 - / - 섬유 아세포 마이그레이션 과정 중 더 편광 캠프를 포함, 우리는 섬유 아세포의 이동이 MRP4 매개 규제 캠프 의존한다는 가설을 세웠다. 하류 메커니즘을 이해하기 위해 직접 아직 다각적 접근했다. 관련 및 MRP4와 상호 작용의 단백질을 식별하기 위해, 우리는 이상 MRP4을 표현하는 HEK293 세포에서 MRP4 함유 고분자 복합체를 면역. 질량 분석기를 사용하여, 우리는 여러 MRP4 - 상호 작용하는 단백질을 확인하고 독창성 통로 분석 (IPA)를 사용하여 자신의 상호를 분석 하였다. IPA는 (구조 및 기능 모두) 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하고 특히 생리와 병리에 자신의 기여를 탐구하는 유용한 도구입니다문헌과 실험 증거 (15, 16)에 따라 이벤트. IPA는 캠프 및 cGMP의 분자 (17) 신호 키 어디 F-액틴은 세포 이동의 맥락에서 MRP4의 주요 다운 스트림 대상이라고 지적했다. 이러한 데이터는 더 높은 콘텐츠 현미경으로 확인 하였다. 높은 콘텐츠 현미경 캡처하고보다 편리하고 정확하고 높은 처리량 방법 (18) 이러한 세포 이동과 같은 세포 행동을 분석 할 수 있습니다. 고 함량 현미경 데이터는 섬유 아세포 이동에 MRP4의 효과가 완전히 PKA 17 액틴 세포 골격 또는 억제의 중단에 폐지되어 보였다. 또한, 우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 실시간으로 세포를 이전에 PKA 역학을 모니터링 PKA 센서 기반의 사용. FRET 기반 키나제 센서는 일반적으로 CFP와 YFP의 형광 19-21에 의해 형벌 특정 인산화 기판 펩타이드로 구성되어 있습니다. pmAKAR3는 향상과 나된다mbrane는 forkhead 관련 도메인 1 (FHA1)와 PKA 기판 순서 LRRATLVD 5,22를 포함 FRET 기반 PKA 센서를 대상으로. PKA 촉매 서브 유닛이 증가하여 pmAKAR3의 인산화는 CFP와 YFP (19) 사이의 신호를 FRET. 센서로 지질 개질 영역의 삽입은 특히 막 구획 23, PKA 역학 모니터링 세포막에 타겟팅. pmAKAR3를 사용하여, 우리는 증명이 Mrp4 마이그레이션의 첨단 - / - 결과적으로 세포의 리딩 엣지 (17)의 대뇌 피질 굴지의 형성을 증가 Mrp4 + / + 섬유 아세포,보다 더 편광 PKA의 활성을 나타내 섬유 아세포. 함께, 이러한 이벤트는 MRP4의 부재에서 더 나은 휴대 편광 빠르게 방향 세포 이동의 결과. 우리의 구체적이고 직접적인 방법은 MRP4 주요 다운 스트림 대상을 식별하는 중요한을 제공하지만, 같은섬유 아세포 마이그레이션 MRP4 의존 규제의 아직 미개척기구.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11668-027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte Zoom</td>
			<td style="width:324px;">Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well IncuCyte Image-Lock microplates&#160;</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;">4493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>L5288</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H-89</td>
			<td style="width:324px;">Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)</td>
			<td>BML-EI196</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35-mm glass-bottomed dishes&#160;</td>
			<td style="width:324px;">(MatTek Corporation; Ashland, MA)</td>
			<td style="width:187px;">P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">31985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">FRET microscopy system</td>
			<td>Olympus inverted microscope (IX51)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Hamamatsu, Japan</td>
			<td style="width:187px;">ORCA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">SlideBook software 5.5</td>
			<td style="width:324px;">Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ingenuity Pathway Analysis software</td>
			<td>IPA, QIAGEN Redwood City,</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forskolin</td>
			<td>Tocris (Ellisville, MO).&#160;</td>
			<td style="width:187px;">1099</td>
			<td>Stock in100% EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM F-12&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">14025-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Excel</td>
			<td style="width:324px;">Microsoft</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">PBS</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td>R-001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration

약제 내성 단백질 4 (MRP4)은 막 수송의 ATP 결합 카세트 가족의 일원이며, 주기적 뉴클레오티드의 내생 유출 수송이다. 세포 내 사이 클릭 염기 농도를 조절함으로써, MRP4는 세포 이동을 포함한 다수의 환상 뉴클레오티드 - 의존성 세포 사건을 조절할 수있다. 이전에는 MRP4의 부재, 섬유 아세포 세포가 세포 내 환상 뉴클레오티드의 더 높은 수준을 함유 빠르게 마이그레이션 수 보였다. 이러한 발견의 기본 메커니즘을 이해하기 위해서, 우리는 직접 아직 다각적 인 접근 방식을 채택했다. 먼저, 질량 분광법에 의해이어서 면역을 사용 MRP4 과발현 세포 시스템에서 MRP4 잠재적 상호 작용 단백질 복합체를 격리. MRP4의 상호 작용 체에 고유 한 단백질을 식별 한 후, 우리는 신호 전달의 맥락에서 이러한 단백질 - 단백질 상호 작용의 역할을 탐구하는 독창성 통로 분석 (IPA)을 이용했다. 우리는 포를 밝혀세포 이동에 MRP4의 효과의 주요 중재자로 세포 이동에 MRP4 단백질 복잡하고 확인 F - 굴지의 tential 역할. 이 연구는 또한 철새 현상의 핵심 선수로 캠프 및 cGMP의의 역할을 강조했다. 높은 콘텐츠 현미경을 사용하여, 우리는 세포 마이그레이션 분석을 수행하고 섬유 아세포의 이동에 MRP4의 효과가 완전히 캠프에 의존 키나제 A (PKA)의 액틴 세포 골격 또는 억제의 중단에 의해 폐지되는 것을 관찰했다. 실시간 마이그레이션 셀에 변조 신호 시각화하기 위해, 우리는 PKA 활성을 측정하기위한 FRET 기반 센서를 활용 발견, Mrp4 마이그레이션의 첨단 근처 더 편광 PKA 활동의 존재 - / -에 비해 섬유 아세포, Mrp4 + / 섬유 아세포를 +. 이것은 차례로 피질 액틴 형성을 증가 이전의 과정을 증대. 우리의 접근 방식은 MRP4 하류 작용하는 단백질의 식별을 가능하게하고 이상 우리에게 제공섬유 아세포 마이그레이션 MRP4 의존 조절에 관여하는 메커니즘의보기.

섬유 아세포 이동에 MRP4의 효과를 연구하기 위해, 우리는 높은 함량 현미경 (14)을 이용하여 상처 치유 검정을 사용 하였다. 정확한 상처에서 격리 MEFs에의 합류 단일 층에 만들어진 하나 Mrp4 - / - 또는 Mrp4 + / + 마우스, 이미지는 24 시간 동안 1 시간 간격으로 촬영 하였다. Mrp4 + / + MEFs에 (그림 2)?...

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Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

MRP4는 세포 이동에 최근에 밝혀 역할 등 다양한 주기적 뉴클레오티드 종속 신호 이벤트를 조절한다. 우리는 섬유 아세포 이전의 미세 조정 조절에 중요​​한 역할을 고유 MRP4의 상호 작용 체의 식별 결과 MRP4의 하류 분자 표적을 해명하기 위해 직접하지만, 다각적 인 접근 방법을 설명합니다.

방법은 섬유 아세포 마이그레이션의 규정에 Mrp4 함유 Macromolecular의 단지를 공부하기

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Zebrafish의 각막 실질 세포의 Explants는 피부 상처 치유에 집단 셀 마이그레이션 및 재 상피화을 연구하는

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

연구

발생학

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

상처 스크래치 분석의 최적화 가용성 담배 연기 추출물에 의한 손상 후 쥐 중간 엽 기질 세포 이동의 변화를 감지 할

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

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방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

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라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

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Stentor 에 중생의 연구 방법

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

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초파리 멜라노가스터에서 내분비 장애를 테스트하는 방법

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...