Name: methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration
Uploaded: 2016-05-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.

1. Påhittighet Pathway Analys <ol><li> Uppladdning Protein-interactome dataset <ol><li> Sätt i proteiner / generna av intresse i ett kalkylblad med sina unika gen identifierare (företrädesvis gen symboler och gen identifikationsnummer som erhållits med spektrometriska uppgifter mass). </li><li> Tilldela en kolumn i kalkylbladet för Gene identifieringsnummer och en kolumn för observationell värde (eg., Vik-förändring eller p-värde). Välj &quot;innehåller kolumnrubriken&quot; alternativ för att vi...

<ol>
	<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>Arora, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+cyclic+nucleotide+signaling:+a+question+of+when,+where,+and+why?.">Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why?.</a> Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).</li><li>Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+the+cAMP-dependent+protein+kinase+during+chemotactic+cell+migration.">Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).</li><li>Lim, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+protein+kinase+A+activation+at+the+leading+edge+of+migrating+cells.">Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).</li><li>Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+protein+kinase+A+activity+during+cell+migration+is+mediated+by+A-kinase+anchoring+protein+AKAP+Lbc.">Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc.</a> J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).</li><li>Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+signals+to+the+Arp2/3+complex.">Integration of signals to the Arp2/3 complex.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+assembly+associated+with+protrusion+and+adhesion+in+cell+migration.">Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration.</a> Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).</li><li>Raftopoulou, M., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Rho+GTPases+lead+the+way.">Cell migration: Rho GTPases lead the way.</a> Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).</li><li>Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ena/VASP+proteins:+regulators+of+the+actin+cytoskeleton+and+cell+migration.">Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).</li><li>Hara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+MRP4+prevents+and+reverses+pulmonary+hypertension+in+mice.">Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice.</a> J Clin Invest. 121 (7), (2011).</li><li>Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+protein+4+(MRP4/ABCC4):+a+versatile+efflux+tra+(7),+2888-289nsporter+for+drugs+and+signalling+molecules.">Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules.</a> Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).</li><li>Cheepala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide+compartmentalization:+contributions+of+phosphodiesterases+and+ATP-binding+cassette+transporters.">Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-drug+resistance+protein+4+(MRP4)-mediated+regulation+of+fibroblast+cell+migration+reflects+a+dichotomous+role+of+intracellular+cyclic+nucleotides.">Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides.</a> J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).</li><li>Popovici, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+heterologous+approaches+to+identify+the+LET-756/FGF+interactome.">Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome.</a> BMC Genomics. 7 (105), (2006).</li><li>Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactome+mapping+suggests+new+mechanistic+details+underlying+Alzheimer's+disease.">Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease.</a> Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+and+actin+play+critical+roles+as+downstream+effectors+in+MRP4-mediated+regulation+of+fibroblast+migration.">PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration.</a> Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).</li><li>Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carnitine+palmitoyltransferase+1A+(CPT1A):+a+transcriptional+target+of+PAX3-FKHR+and+mediates+PAX3-FKHR-dependent+motility+in+alveolar+rhabdomyosarcoma+cells.">Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells.</a> BMC Cancer. 12 (154), (2012).</li><li>Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+reporters+of+protein+kinase+A+activity+reveal+impact+of+substrate+tethering.">Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).</li><li>Sinha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forster+resonance+energy+transfer+-+an+approach+to+visualize+the+spatiotemporal+regulation+of+macromolecular+complex+formation+and+compartmentalized+cell+signaling.">Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).</li><li>Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+imaging+protein+phosphorylation+in+single+living+cells.">Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells.</a> Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).</li><li>Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+propagation+from+membrane+messengers+to+nuclear+effectors+revealed+by+reporters+of+phosphoinositide+dynamics+and+Akt+activity.">Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).</li><li>Yamaguchi, H., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+actin+cytoskeleton+in+cancer+cell+migration+and+invasion.">Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion.</a> Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).</li><li>Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+migration+during+angiogenesis.">Endothelial cell migration during angiogenesis.</a> Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).</li><li>Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+regulates+migration+of+lung+alveolar+epithelial+cells+through+activation+of+Rac1+and+matrix+metalloproteinase-2.">CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).</li><li>Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+at+a+glance.">Cell migration at a glance.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).</li><li>Zaccolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded,+fluorescent+indicator+for+cyclic+AMP+in+living+cells.">A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells.</a> Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).</li></ol>

Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts...

Cellmigration är en komplicerad flerstegsprocess. Studier har visat att under migrationsceller är polariserade i främre och bakre kanter. Genom att följa den extracellulära matrisen, ger framkant drag nödvändig för cellkroppen att röra sig framåt. Slutligen bakkants släpper bakre fästen och slutför migreringen cykeln 1,2. Cell polarisering för effektiv cellmigration regleras av rumslig segregering av intracellulär signalering. Cellular andra budbärare, såsom cAMP, medierar uppdelning av de signaleringshändelser som erfordras för finjusteras riktad cellmigration 3,4. Preferens ansamlingar av cAMP och cAMP-beroende kinas PKA aktivitet i framkant spelar nyckelroller i riktad cell migration 5,6. Genom fosforylering små GTPaser såsom Ras relaterade C3 botulinumtoxin substrat (Rac) och celldelning kontrollprotein 42 homolog eller Cdc42, PKA aktiverar aktin-relaterat protein 2/3 (Arp 2/3) vid framkanten och inducerar bildandet av lamellipodia 7-9. PKA fosforylerar också en anti-kapslingsmedel, vasodilator stimulerade fosfoprotein (VASP), därigenom reglerar oscillerande cykler av membran förlängning och indragning 10,11. I celler, är cAMP-nivåer regleras av tre huvudprocesser: i) syntes genom adenylatcyklas, ii) nedbrytning av fosfodiesteraser, och iii) transport av membranbundna uttransportörer 3. Multiresistens protein 4 (MRP4), en medlem av ATP-bindande kassett (ABC) familj av membrantransportörer, fungerar som en endogen effluxtransportören av cykliska nukleotider. Därför kan MRP4 reglera intracellulära cAMP-nivåer och cAMP-beroende cellulära signalerings 11-13. Vi har tidigare visat att i Mrp4 - / - fibroblaster innehåller relativt höga halter av cykliska nukleotider och migrera snabbare compared till Mrp4 + / + fibroblaster 14. Vi rapporterade också en bifasisk effekt av cykliska nukleotider på fibroblast migration. Baserat på tidigare studier och vår slutsats att Mrp4 - / - fibroblaster innehåller mer polariserad cAMP under migration, hypotes vi att detta MRP4-medierad reglering av fibroblast migration är cAMP-beroende. För att förstå nedströms mekanismen, tog vi en direkt ändå mångfacetterad strategi. För att identifiera proteiner associerade och i samspel med MRP4, immunoprecipiterade vi MRP4 innehållande makromolekylära komplex från HEK293-celler som överuttrycker MRP4. Använda masspektrometri identifierade vi flera MRP4-interagerande proteiner och analyseras deras sammankoppling med hjälp av Uppfinningsrikedom Pathway Analysis (IPA). IPA är ett användbart verktyg för att analysera protein-proteininteraktioner (både strukturella och funktionella) och utforska sina bidrag i synnerhet fysiologiska och patologiskahändelser baserade på litteratur och experimentella bevis 15,16. IPA indikerade att F-aktin är en stor nedströms mål av MRP4 inom ramen för cellmigration där cAMP och cGMP är nyckeln signalmolekyler 17. Dessa data bekräftades ytterligare genom hög halt mikroskopi. Hög halt mikroskopi kan fånga och analysera cell beteenden såsom cellmigration i ett mer praktiskt, noggrann och hög genomströmning sätt 18. Mikroskopi data av hög-innehåll visade att effekten av MRP4 på fibroblast migration är helt avskaffas vid avbrott i aktin cytoskelettet eller hämning av PKA 17. Dessutom använde vi en Förster resonansenergiöverföring (FRET) -baserade PKA sensor för att övervaka de PKA dynamiken i migrerande celler i realtid. FRET-baserade kinas sensorer består vanligtvis av särskilda fosforylering substratpeptider flankerad av GFP och YFP fluoroforer 19-21. pmAKAR3 är en förbättrad och jagmbrane riktade FRET-baserade PKA sensor som innehåller forkhead-associerad domän 1 (FHA1) och PKA substratsekvensen LRRATLVD 5,22. Fosforylering av pmAKAR3 av PKA katalytiska subenheten ökningar FRET signal mellan GFP och YFP 19. Införing av en lipid modifiering domän i sensorn är inriktad den till plasmamembranet för att övervaka PKA dynamik, speciellt på membranavdelningen 23. Med användning pmAKAR3 visade vi att den främre kanten av migrerande Mrp4 - / - fibroblaster uppvisade mer polariserad PKA aktivitet än Mrp4 + / + fibroblaster, vilket i sin tur ökade den kortikala aktin bildning vid cellens främre kant 17. Tillsammans utgör dessa händelser lett till bättre cellulär polarisering och snabbare riktad cellmigrering i frånvaro av MRP4. Vår specifika och direkt metod identifierat viktiga nedströms mål för MRP4 och utgör en viktig, men somav ännu outforskade mekanism för MRP4 beroende reglering av fibroblast migration.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11668-027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IncuCyte Zoom</td>
			<td style="width:324px;">Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well IncuCyte Image-Lock microplates&#160;</td>
			<td>Essen BioScience</td>
			<td style="width:187px;">4493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Latrunculin B</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>L5288</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">H-89</td>
			<td style="width:324px;">Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)</td>
			<td>BML-EI196</td>
			<td>Stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35-mm glass-bottomed dishes&#160;</td>
			<td style="width:324px;">(MatTek Corporation; Ashland, MA)</td>
			<td style="width:187px;">P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:324px;">Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Opti-MEM Reduced Serum Media</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">31985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">FRET microscopy system</td>
			<td>Olympus inverted microscope (IX51)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:324px;">Hamamatsu, Japan</td>
			<td style="width:187px;">ORCA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">SlideBook software 5.5</td>
			<td style="width:324px;">Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ingenuity Pathway Analysis software</td>
			<td>IPA, QIAGEN Redwood City,</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forskolin</td>
			<td>Tocris (Ellisville, MO).&#160;</td>
			<td style="width:187px;">1099</td>
			<td>Stock in100% EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM F-12&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">14025-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Excel</td>
			<td style="width:324px;">Microsoft</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">PBS</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td>R-001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:324px;">Invitrogen(Carlsbad, CA)&#160;</td>
			<td style="width:187px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study mrp4-containing macromolecular complexes in the regulation of fibroblast migration

Multiresistens protein 4 (MRP4) är en medlem av den ATP-bindande kassett familj av membrantransportörer och är en endogen effluxtransportören av cykliska nukleotider. Genom att modulera intracellulär cyklisk nukleotid koncentration, kan MRP4 reglera flera cykliska nukleotid-beroende cellulära händelser, inklusive cellmigration. Tidigare visade vi att i avsaknad av MRP4, fibroblastceller innehåller högre halter av intracellulära cykliska nukleotider och kan migrera snabbare. För att förstå de bakomliggande mekanismerna för detta konstaterande, antog vi en direkt ändå mångfacetterad strategi. Först isolerade vi potentiella samverkande proteinkomplex av MRP4 från en MRP4 överuttryck cellsystem med hjälp av immunoprecipitation följt av masspektrometri. Efter att ha identifierat unika proteiner i MRP4 interactome, utnyttjade vi Påhittighet Pathway Analysis (IPA) för att utforska rollen av dessa protein-proteininteraktioner i samband med signaltransduktion. Vi klar potial roll MRP4 proteinkomplexet i cellmigrering och identifierade F-aktin som en viktig mediator av effekten av MRP4 på cellmigration. Denna studie underströk också betydelsen av cAMP och cGMP som nyckelspelare i migrationsfenomenet. Med hjälp av hög halt mikroskopi, utförde vi cellmigrationsanalyser och observerade att effekten av MRP4 på fibroblast migration är helt avskaffas genom avbrott i aktincytoskelettet eller inhibering av cAMP-beroende kinas A (PKA). Att visualisera signalering modulationer i en vandrande cell i realtid, utnyttjade vi en FRET-baserad sensor för mätning av PKA-aktivitet och fann, närvaron av mer polariserad PKA aktivitet i närheten av den främre kanten av migrerande Mrp4 - / - fibroblaster, jämfört med Mrp4 + / + fibroblaster. Detta i sin tur ökad kortikal aktin bildning och förstärkt processen för migration. Vår strategi möjliggör identifiering av proteinerna som agerar nedströms till MRP4 och ger oss en överutsikt över deltar i MRP4 beroende reglering av fibroblast migration mekanism.

För att studera effekten av MRP4 på fibroblast migration, använde vi en sårläkande analys som utnyttjar hög halt mikroskopi 14. Precisa sår gjordes på sammanflytande monoskikt av MEFs isolerade från antingen Mrp4 - / - eller Mrp4 + / + möss och bilder togs vid 1 h intervall under 24 h. Vi observerade en högre migrationshastighet för Mrp4 - / - MEF jämfört med Mrp4 ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration at JoVE.com

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

MRP4 reglerar olika cykliska nukleotid-beroende signalering händelser inklusive en nyligen klar roll i cellmigration. Vi beskriver en direkt, men olika angreppssätt för att reda ut nedströms molekylära mål av MRP4 resulterar i identifiering av en unik MRP4 interactome som spelar nyckelroller i finjusteras reglering av fibroblast migration.

Metoder för att studera Mrp4 innehållande Makromolekylär i regleringen av Fibroblast Migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Zebrafisk Keratocyte Explants att studera Kollektiv Cell Migration och reepithelialization i Kutan sårläkning

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabil och effektiv genetisk modifiering av celler i vuxen mus V-SVZ för analys av neurala stamceller autonoma och icke-självständiga effekter

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimering av sår Scratch analys för att upptäcka förändringar i Murine Mesenkymala Stromal Cell Migration Efter Skador av lösliga cigarett rökextrakt

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder för att undersöka lymfkörtel och hemocyter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Ljus Sheet-baserade fluorescensmikroskopi av levande eller fixeras och färgas<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryon

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Metoder för studier av förnyelse i Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkt härstamning omprogrammering av vuxen mus Fibroblast till erytroid stamfäder

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiella cellmigration i den framkallande Chick fiberoptiska Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Metoder för att testa endokrina störningar i Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmonterad in situ-hybridisering i Zebrafish Embryon och Tube Formation Assay i iPSC-ECs att studera rollen av Endoglin i vaskulär utveckling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...