Name: cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00
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The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

1. Croissance et récolte des cellules de levure <ol><li> Dans le cas contraire l&#39;analyse de la cinétique de dégradation d&#39;une protéine endogène de levure, transformer la souche (s) de levure désirée avec un plasmide codant pour la protéine d&#39;intérêt. Des méthodes fiables pour la transformation de la levure ont été décrits précédemment 37. </li><li> Inoculer levure dans 5 ml de milieu approprié (par exemple, synthétique défini (SD) milieu sélectif pour le maintien du ...

Dans cet article, un procédé d&#39;analyse de la cinétique de dégradation des protéines est présentée. Cette technique peut être appliquée facilement à une large gamme de protéines dégradées par une variété de mécanismes. Il est important de noter que les expériences de chasse de cycloheximide rapport sur la cinétique de dégradation de la piscine de l&#39;état d&#39;équilibre d&#39;une protéine donnée. D&#39;autres techniques peuvent être utilisées pour analyser la cinétique de la dégradation ...

Les protéines remplissent des fonctions cruciales dans pratiquement tous les processus cellulaire. De nombreux processus physiologiques nécessitent la présence d&#39;une protéine spécifique (ou protéines) pendant une période de temps définie ou dans des circonstances particulières. Les organismes surveillent donc et régulent l&#39; abondance de protéines pour répondre aux besoins cellulaires 1. Par exemple, des cyclines (protéines qui contrôlent la division cellulaire) sont présents à des phases spécifiques du cycle cellulaire et la perte des niveaux de cycline réglementés a été associée à la formation de tumeurs malignes 2. En plus de la régulation des niveaux de protéines pour répondre aux besoins cellulaires, les cellules utilisent des mécanismes de contrôle de la qualité de dégradation pour éliminer un repliement des molécules de protéines unassembled, ou autrement aberrantes 3. Le contrôle de l&#39;abondance des protéines implique la régulation à la fois la synthèse macromoléculaire (transcription et traduction) et de la dégradation (de désintégration de l&#39;ARN et la protéolyse). la dégradation des protéines avec facultés affaiblies ou excessive contribue à de multiples pathologies, Y compris le cancer, la fibrose kystique, des maladies neurodégénératives et des troubles cardio - vasculaires 4-8. Mécanismes protéolytiques représentent donc des cibles thérapeutiques prometteuses pour une gamme de maladies 9-12. Analyse des protéines à un seul point du temps (par exemple, par western blot 13, cytométrie en flux 14, ou la microscopie à fluorescence 15) donne un aperçu de la protéine abondance à l&#39;état stable sans révéler la contribution relative de la synthèse ou de dégradation. De même, des dosages de rapporteur à base de croissance reflètent stables les taux de protéines de l&#39; État sur ​​une période de temps prolongée sans discrimination entre les influences de la synthèse et la dégradation 15-20. Il est possible de déduire la contribution des processus de dégradation à des niveaux de protéines de l&#39; état ​​d&#39; équilibre en comparant l&#39; abondance avant et après l&#39; inhibition des composants spécifiques du mécanisme de dégradation (par exemple, en inactivant pharmacologiquement la proteasome 21 ou assommant un gène hypothétique d&#39;être requis pour la dégradation 13). Un changement dans les niveaux de protéines de l&#39; état ​​d&#39; équilibre après l&#39; inhibition des voies de dégradation fournit des preuves solides pour la contribution de la protéolyse au contrôle de la protéine abondance 13. Cependant, une telle analyse ne fournit toujours pas d&#39;informations sur la cinétique de renouvellement des protéines. Chase cycloheximide suivie par western blot surmonte ces faiblesses en permettant aux chercheurs de visualiser la dégradation des protéines dans le temps 22-24. En outre, parce que la détection de la protéine suivante chase cycloheximide est généralement effectuée par Western blot, les isotopes radioactifs et les étapes d&#39;immunoprécipitation longues ne sont pas nécessaires pour la chasse de cycloheximide, contrairement à de nombreuses techniques de chasse d&#39;impulsions couramment utilisés, qui sont également effectuées pour visualiser la dégradation des protéines 25. Cycloheximide a d&#39;abord été identifié comme étant un composé anti-fongique appropriéeliens produits par les Streptomyces bactérie à Gram positif griseus 26,27. Elle est une molécule cellulaire perméable qui inhibe spécifiquement cytosoliques eucaryotes (mais pas des organites) en altérant la traduction ribosomique translocation 28-31. Dans une expérience de chasse à la cycloheximide, le cycloheximide est ajouté aux cellules, et des aliquotes de cellules sont prélevées immédiatement et à des moments spécifiques après l&#39; addition du composé 22. Les cellules sont lysées, et l&#39;abondance de protéines à chaque point de temps est analysé, typiquement par western blot. Des diminutions de l&#39;abondance des protéines après l&#39;addition de cycloheximide peuvent être en toute confiance attribuée à la dégradation des protéines. Une protéine instable va diminuer en abondance au fil du temps, tandis que d&#39;une protéine relativement stable présentera peu de changements dans l&#39;abondance. Mécanismes de dégradation sélective des protéines ont été hautement conservée tout au long de Eukarya. Une grande partie de ce qui est connu à propos de la dégradation des protéines a été appris en premierle modèle eucaryote unicellulaire, Saccharomyces cerevisiae (levure de bourgeonnement) 25,32-36. Des études avec des levures sont susceptibles de continuer à fournir des idées nouvelles et importantes dans la dégradation des protéines. Une méthode pour la chasse de cycloheximide dans les cellules de levure suivie d&#39;une analyse western blot de protéines abondance est présentée ici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="607">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-961-32</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td style="width:105px;">Dot Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028068</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:216px;">New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:119px;">M1053-0450</td>
			<td style="width:167px;">A tube roller is recommended to maintain overnight&#160; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:119px;">M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td style="width:105px;">Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Centrifuge 5430</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td style="width:105px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.205</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22364120</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:216px;">Analog Dri-Bath Heaters</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1172011AQ</td>
			<td style="width:167px;">It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &#176;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Heating block for 12 x 15-ml conical tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-473-70</td>
			<td style="width:167px;">For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-9Q</td>
			<td style="width:167px;">For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td style="width:105px;">Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IPFL00010</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td style="width:105px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">459250</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Règlement de la protéine abondance est cruciale pour pratiquement tous les processus cellulaire. Abondance des protéines reflète l&#39;intégration des taux de synthèse des protéines et la dégradation des protéines. De nombreux essais de rapports sur la protéine abondance (par exemple, un seul point de temps western blot, cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence, ou des dosages de rapporteur basées sur la croissance) ne permettent pas la discrimination des effets relatifs de la traduction et de la protéolyse sur les niveaux de protéines. Cet article décrit l&#39;utilisation de chasse cycloheximide suivie par western blot pour analyser spécifiquement la dégradation des protéines dans le eucaryote unicellulaire modèle, Saccharomyces cerevisiae (levure en herbe). Dans cette procédure, les cellules de levure sont incubées en présence du cycloheximide inhibiteur de la traduction. Des portions aliquotes de cellules sont prélevées immédiatement après et à des moments spécifiques après l&#39;addition de cycloheximide. Les cellules sont lysées, et les lysats sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide for analyse par transfert Western de protéines abondance à chaque point de temps. La procédure de poursuite de cycloheximide permet la visualisation de la cinétique de dégradation de la population de l&#39;état d&#39;équilibre d&#39;une variété de protéines cellulaires. La procédure peut être utilisée pour étudier les exigences génétiques pour et les influences environnementales sur la dégradation des protéines.

Pour illustrer la méthodologie de poursuite de cycloheximide, la stabilité de deg1 -Sec62 (Figure 1), un modèle de levure réticulum endoplasmique (RE) dégradation -Associated (ERAD) substrat, a été analysé 42-44. Dans DGAER, des enzymes ubiquitine ligase de contrôle de qualité fixer de manière covalente des chaînes de la petite protéine ubiquitine à des protéines aberrantes localisées sur la membrane du RE. De telles protéines polyubi...

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Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

L&#39;analyse de cycloheximide Chase dans la dégradation des protéines<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

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