Name: cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost's Office and Department of Biology.

효모 세포의 1. 성장과 수확 <ol><li> 내인성 효모 단백질 분해 동력학을 분석하지 않으면, 관심있는 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 원하는 효모 균주 (들)을 변형. 효모를 형질 전환하기위한 신뢰할 수있는 방법은 이전에 37을 설명 하였다. </li><li> 적절한 배지 5ml에 접종, 효모 (예를 들어, 형질 전환 된 세포를 비 형질 전환 세포에 대한 비 선택적 효모 추출물 - 펩톤 - 덱 스트...

본 논문에서는 단백질 분해의 동력학을 분석하는 방법이 제시된다. 이러한 기술은 용이하게하는 다양한 메커니즘에 의해 열화 된 단백질의 범위에 적용될 수있다. 또한 사이클로 헥 체이스 실험 주어진 단백질의 정상 풀 분해 동역학보고 것이 중요하다. 다른 기술은 단백질의 특정 집단의 분해 동력학을 분석하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 초기 폴리 펩타이드의 degradative 운명은 펄스 추적 분?...

단백질은 거의 모든 세포 과정에 중요한 기능을 수행합니다. 많은 생리 학적 과정은 시간 또는 특정 상황에서 정의 된 기간 동안에 특정 단백질 (또는 단백질)의 존재를 필요로한다. 생물 따라서 모니터링 및 세포 요구 한 사항을 충족하기 위해 단백질 풍부를 조절한다. 예를 들어, 사이클린 (세포 분열 제어 단백질)는 세포주기의 특정 단계에 존재하며, 규제 사이클린 레벨의 손실은 악성 종양이 형성과 관련되어있다. 셀룰러 요구를 충족하기 위해 단백질 레벨을 조절하는 것 외에도, 세포는 잘못 폴딩, 조립되지 않은, 또는 기타 비정상적 단백질 분자 (3)을 제거 degradative 품질 제어 메커니즘을 사용한다. 단백질 풍부의 제어는 고분자 합성 (전사 및 번역) 및 분해 (RNA의 부패와 단백질 분해) 모두의 규정을 포함한다. 장애 또는 과도한 단백질 분해 여러 병리에 기여암, 낭포 성 섬유증, 신경 변성 상태, 및 심혈관 질환을 포함 4-8. 단백질 분해 메커니즘은 따라서 질병 9-12의 범위 유망한 치료 목표를 나타냅니다. 하나의 시점에서 단백질의 분석은 합성 또는 분해의 상대적 기여도를 공개하지 않고 정상 상태의 단백질 풍부의 스냅 샷을 제공합니다 (예를 들어, 웨스턴 블롯 (13)에 의해, 세포 계측법 (14), 또는 형광 현미경 (15) 흐름). 유사 성장 기반 리포터 분석은 합성 및 분해 15-20의 영향을 구별하지 않고 오랜 기간 동안 정상 상태의 단백질 수준을 반영한다. 이는 전에 풍부한 비교 및 약리학 보호 자전거를 비활성화하여, 예 degradative기구 (특정 성분을 억제 후, 정상 상태의 단백질 수준 degradative 프로세스의 기여도를 추정 할 수있다asome 21 가정 유전자를 노크는 분해 13)이 필요합니다. degradative 경로를 억제 한 후 정상 상태의 단백질 수준의 변화는 단백질이 풍부 (13)의 제어에 단백질 분해의 기여에 대한 강력한 증거를 제공합니다. 그러나, 그러한 분석은 아직 단백질 회전율의 동역학에 관한 정보를 제공하지 않는다. 웨스턴 블롯 다음 사이클로 헥시 미드 체이스는 연구자들이 시간이 22 ~ 24에 걸쳐 단백질 분해를 시각화 할 수 있도록함으로써 이러한 약점을 극복한다. 사이클로 헥시 미드 체이스 다음과 같은 단백질의 검출은 일반적으로 서쪽 블로 팅, 방사성 동위 원소 및 긴 면역 침전 단계에서 수행되기 때문에 또한, 또한 단백질 분해 (25)를 시각화하기 위해 수행된다 일반적으로 사용되는 펄스 추적 기술, 달리, 사이클로 헥시 미드 체이스 필요하지 않습니다. 사이클로 헥시 미드 먼저 항진균 적절한 가진 화합물로 확인되었다26, 27 griseus의 그램 양성 박테리아 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)에 의해 생성 된 관계. 이것은 특히 리보솜 전위 28-31을 손상하여 진핵 세포질 (그러나 organellar 생략) 번역을 저해하는 세포 투과성 분자이다. 사이클로 헥 체이스 실험에서 사이클로 헥시 미드는 세포에 첨가하고, 세포의 분취 량을 즉시 및 화합물 (22)을 첨가 한 다음에 특정 시점에서 수집된다. 세포를 용해하고, 각 시점에서의 단백질 존재 량은 전형적으로 웨스턴 블롯에 의해 분석된다. 자신 단백질 분해에 기인 할 수있는 사이클로 헥시 미드의 첨가 다음 단백질 풍부 감소한다. 상대적으로 안정적인 단백질이 풍부 작은 변화를 보이는 반면 불안정한 단백질은 시간이 지남에 풍부하게 감소 할 것이다. 선택적 단백질 분해의 메커니즘은 매우 Eukarya에 걸쳐 보존되어있다. 단백질 분해에 대해 알려진 내용의 대부분은 처음에 알게되었다모델 단세포 진핵 생물, 사카로 마이 세스 세레 비지에 (신진 효모) 25,32-36. 효모와 연구는 단백질 분해에 새롭고 중요한 통찰력을 계속 제공 할 가능성이 높다. 단백질 풍부한 웨스턴 블롯 분석 한 다음 효모 세포에 사이클로 헥시 미드 추격하는 방법이 여기에 표시됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="607">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-961-32</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td style="width:105px;">Dot Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028068</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:216px;">New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:119px;">M1053-0450</td>
			<td style="width:167px;">A tube roller is recommended to maintain overnight&#160; starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:119px;">M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td style="width:105px;">Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Centrifuge 5430</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td style="width:105px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.205</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22364120</td>
			<td style="width:167px;">Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="357">
			<td height="357" style="height:357px;width:216px;">Analog Dri-Bath Heaters</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1172011AQ</td>
			<td style="width:167px;">It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 &#176;C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Heating block for 12 x 15-ml conical tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-473-70</td>
			<td style="width:167px;">For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-9Q</td>
			<td style="width:167px;">For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td style="width:105px;">Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IPFL00010</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td style="width:105px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">459250</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td style="width:167px;">Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cycloheximide chase analysis of protein degradation in saccharomyces cerevisiae

단백질 풍부 규제는 거의 모든 세포 과정에 매우 중요합니다. 단백질 풍부 단백질 합성 및 단백질 분해의 속도의 통합을 반영한다. 단백질 풍부한보고 많은 분석은 단백질 수준에서 번역 및 단백질 분해의 상대적인 효과의 차별을 허용하지 않습니다 (예를 들어, 단일 시점 웨스턴 블로 팅, 세포 계측법 형광 현미경, 또는 성장 기반 기자 분석 흐름). 이 문서는 특히 모델 단세포 진핵 생물의 단백질 분해를 분석하는 서양 블롯 다음 사이클로 헥시 미드 체이스의 사용, 사카로 마이 세스 세레 비지에 (신진 효모)에 대해 설명합니다. 이 과정에서, 효모 세포는 번역 억제제 인 사이클로 헥시 미드의 존재 하에서 배양 하였다. 세포의 분액 후 cycloheximide에 첨가 한 다음에 특정 시점에서 즉시 수집된다. 세포를 용해하고, 용 해물은 fo를 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 분리되고각 시점에서 단백질 풍부의 웨스턴 블롯 분석을 r에. 사이클로 헥 체이스 과정은 세포 단백질의 다양한 정상 모집단의 분해 동태 가시화를 허용한다. 절차는 단백질 분해에 대한 유전 적 및 환경 조건의 영향을 조사하기 위하여 사용될 수있다.

사이클로 헥시 미드 체이스 방법을 설명하기 위해, Deg1 -Sec62의 안정성 (그림 1), 모델 효모 소포체 (ER) -associated 저하 (ERAD) 기판, 42-44을 분석 하였다. ERAD에서 품질 관리 유비퀴틴 리가 아제 효소는 공유 결합 ER 막에 지역화 된 비정상적인 단백질에있는 작은 단백질의 유비퀴틴의 체인을 연결합니다. 이러한 polyubiquitylated 단백질이어서 ER에서 제거...

Watch this Scientific Journal Video about Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

단백질 분해에서의 사이클로 헥시 미드 체이스 분석<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

연구

생물학

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

로 표현 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 규칙 단백질의 정제<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...