Name: isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells
Uploaded: 2016-05-30T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01HL056046 auf PAL und K99HL116769 zu AJT) und das Forschungsinstitut bei Nationwide Kinderkrankenhaus (PAL und AJT).

Ethik-Erklärung: Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien durchgeführt, und es wurde von der Institution Animal Care und Use Committee bei Nationwide Kinderkrankenhaus zugelassen. 1. Vorbereitung / Einstellungen Anmerkung: Diese Isolationstechnik erfordert zwei Langendorff Heizschlangen Seite an Seite angeordnet auf einem Ringständer, und parallel zu einem zirkulierenden Wasserbad verbunden. <ol><li> Schalten Sie Wasserbad zirkuliert und die Temperatur ...

<ol>
	<li>Katz, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arterioles+in+type+2+diabetic+(db/db)+mice+undergo+a+distinct+pattern+of+remodeling+associated+with+decreased+vessel+stiffness.">Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness.</a> Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).</li><li>Husarek, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiotensin+receptor+blocker+losartan+reduces+coronary+arteriole+remodeling+in+type+2+diabetic+mice.">The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice.</a> Vascul Pharmacol. , (2015).</li><li>Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coronary+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+A1+adenosine+receptor-knockout+mice.">Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).</li><li>Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. 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K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation+in+development+and+disease.">Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease.</a> Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).</li><li>Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SM22+alpha,+a+marker+of+adult+smooth+muscle,+is+expressed+in+multiple+myogenic+lineages+during+embryogenesis.">SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis.</a> Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).</li><li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro:+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts.">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li><li>Fisher, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+phenotypic+diversity+and+function.">Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function.</a> Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+phenotype+and+function+of+vascular+smooth+muscle+cells.">Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells.</a> J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).</li><li>Souza-Smith, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenteric+resistance+arteries+in+type+2+diabetic+db/db+mice+undergo+outward+remodeling.">Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling.</a> PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).</li><li>Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+of+coronary+arteries+in+36+species+of+mammalian+from+mouse+to+giraffe.">Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe.</a> Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).</li></ol>

Der Zweck dieser Studie war es bestehende Zellisolierung Protokolle anzupassen, die Ausbeute an koronaren glatten Gefäß von murinen Herzen zu erhöhen. Die meisten der Pionierarbeit in der Biologie der glatten Gefäßmuskulatur wurde mit kultivierten Rattenaorta glatten Muskelzellen durchgeführt. Diese Studien grundlegende Kenntnisse der molekularen Mechanismen zur Verfügung gestellt , die VSMC Wachstum steuern, Migration und Hypertrophie 7. Da jedoch das Feld fortschritt, wurde es offensichtlich, daß VS...

Das Ziel dieser Methode ist, vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) von der murine Koronarzirkulation für die Verwendung in der Zellkultur und Standard-Zellkultur-Assays zu isolieren. Wir entwickelten diese Technik, die molekularen Mechanismen des vaskulären Remodelling bei Diabetes zu beurteilen. Wir haben früher nach innen hypertrophen Umbau in den septalen koronarer Arteriolen in der db / db - Maus - Modell von Diabetes 1 berichtet. Aufgrund der begrenzten Menge an in den murinen septalen Koronararterien, experimentellen Standardtechniken gefunden Körpergeweben Protein Veränderungen (zB Western - Blot) in db / db Mäusen und Kontrollmäusen sind bestenfalls schwierig. Darüber hinaus haben wir bereits gezeigt , dass der Angiotensin - Rezeptor - Blocker (ARB) Losartan den Umbau in db / db - Mäusen beobachtet 2 reduziert. Daher Isolierung von primären VSMCs aus dem Herz-Kreislauf ermöglicht es uns, weitere Veränderungen im Phänotyp VSMC untersuchen oder aktivierten Signalwege in diabetischen Mäusen, die Beiträgen sein kannting widriger koronaren Arteriolen Umbau. Zahlreiche Studien haben canonical Signalwege VSMCs isoliert aus Nagetier Aorta, anstatt in jedem spezifischen Gefäßbett unter Verwendung erläutert. Wir haben jedoch Gefäßbett spezifischen Umbau in Koronar-, Aorten gezeigt, und mesenterialen Zirkulationen von db / db - Mäusen 1, die VSMCs in jedem Gefäßbett was darauf hindeutet , kann unterschiedlich sein. Daher ist es notwendig, VSMCs von jedem Gefäßbett zu isolieren, um besser auf die pathologischen Veränderungen verstehen in jedem Satz von VSMCs auftreten. Es gibt eine Vielzahl von verschiedenen Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Aorten-VSMCs. Jedoch Derzeit gibt es nur eine Studie , die auf die Isolierung von VSMCs von der Maus Koronarzirkulation 3 veröffentlicht wurde. Teng et al. war der Erste, der ein Verfahren zur Isolierung von VSMCs von der Maus Koronarkreislaufs Bericht zu erstatten; jedoch haben wir das Protokoll erheblich geändert, da sie auch endothelial cel isoliertls. Andere Labors habe auch das Protokoll von Teng et al. Koronaren Arterienmuskelzellen und glatten Atemwegsmuskelzellen 4,5 zu isolieren. Die Veränderungen, wir aufgenommen haben, wird eine Population von Zellen ergeben hoch für VSMCs aus dem Herz-Kreislauf angereichert. Die retrograden Perfusion des isolierten Säugetierherzens oder Langendorff - Technik wurde 1897 von 6 Oscar Langendorff etabliert und wird noch heute weit verbreitet für die Isolierung von Herz - Kreislauf - Zellen verwendet. Die Technik, die hier präsentiert, gepaart mit dem Fortschritt der modernen murinen genetischen Veränderungen, stellt ein wertvolles Instrument zur näheren Untersuchung des molekularen Verhalten von VSMCs aus dem Herz-Kreislauf.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">HEPES 1M solution</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">MT-25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primocin - 20mL</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM NEAA 10 mM 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glut 200 mM - Gibco</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-516-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type-2&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor 25mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14170-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">11 plus pump</td>
			<td style="width:143px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">70-2208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Circulating heated water pump</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any brand will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

Während die Isolierung und Kultivierung von glatten Gefäßmuskelzellen (VSMCs) aus großen Gefäßen gut etabliert ist, haben wir versucht und Kultur VSMCs aus dem Herz-Kreislauf zu isolieren. Herzen mit intakten Aortenbogen wurden über retrograden Langendorff mit Verdauungslösung , enthaltend 300 Einheiten / ml Kollagenase Typ II, entfernt und perfundiert 0,1 mg / ml Sojabohnen - Trypsin - Inhibitor und 1 M CaCl 2. Die perfusates wurden 90 min bei 15 Minuten-Intervallen gesammelt, durch Zentrifugation pelletiert, in plating Medien resuspendiert und auf Gewebekulturschalen plattiert. VSMCs wurden durch die Anwesenheit von SM22α, α-SMA und Vimentin gekennzeichnet. Einer der Hauptvorteile dieser Technik der Verwendung ist die Fähigkeit VSMCs aus dem koronaren Kreislauf von Mäusen zu isolieren. Obwohl die geringe Anzahl von Zellen, für die die Zellen können isoliert koronaren VSMCs werden werden in einer Vielzahl von gut etablierten Zellkulturtechniken und ASSA erhalten können einige Anwendungen begrenzen verwendet, verwendetys. Studien VSMCs aus genetisch veränderten Mäuse können weitere Informationen über Struktur-Funktions-und Signalprozesse, verbunden mit vaskulären Erkrankungen bieten zu untersuchen.

Aufgrund der neuartigen Aspekt unserer koronaren VSMC Isolationstechnik haben wir versucht, um die Reinheit der Zellisolierung zu bestimmen. Maus identifiziert koronaren VSMCs auf der Grundlage ihrer Morphologie und Immunofluoreszenz-Färbung bis zu Passage 2. Aufgrund der Morphologie der Zellen in der Kultur nach der ersten Wäsche, die Isolationsprozedur entfernt effektiv Kardiomyozyten und Endothelzellen. Die VSMCs behalten ihre Morphologie bis Kanal 2 (Figur 1). Es b...

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Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Isolierung und Kulturtechniken von murinen primären vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) aus dem koronaren Kreislauf zu demonstrieren. Sobald VSMCs isoliert wurden, können sie für viele Standardkulturtechniken verwendet werden.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca 2 + Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Forschung

Biologie

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolation der Lungenarterie glatten Muskelzellen aus neugeborenen Mäusen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...