Name: isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells
Uploaded: 2016-05-30T13:00:00
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इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था (R01HL056046 पाल और K99HL116769 एजेटी), और (करने के लिए पाल और एजेटी) अनुसंधान संस्थान राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में।

आचार कथन: इस अध्ययन के स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किया गया था, और यह संस्था पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में मंजूरी दी थी। <p class=...

<ol>
	<li>Katz, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arterioles+in+type+2+diabetic+(db/db)+mice+undergo+a+distinct+pattern+of+remodeling+associated+with+decreased+vessel+stiffness.">Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness.</a> Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).</li><li>Husarek, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiotensin+receptor+blocker+losartan+reduces+coronary+arteriole+remodeling+in+type+2+diabetic+mice.">The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice.</a> Vascul Pharmacol. , (2015).</li><li>Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coronary+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+A1+adenosine+receptor-knockout+mice.">Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).</li><li>Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+attenuates+contraction+of+primary+cultured+rat+airway+smooth+muscle+cells.">Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+two-phase+Ca2++release+and+apoptosis+controlled+by+TRP-ML1+channel+activity+in+coronary+arterial+myocytes.">Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).</li><li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation+in+development+and+disease.">Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease.</a> Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).</li><li>Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SM22+alpha,+a+marker+of+adult+smooth+muscle,+is+expressed+in+multiple+myogenic+lineages+during+embryogenesis.">SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis.</a> Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).</li><li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro:+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts.">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li><li>Fisher, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+phenotypic+diversity+and+function.">Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function.</a> Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+phenotype+and+function+of+vascular+smooth+muscle+cells.">Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells.</a> J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).</li><li>Souza-Smith, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenteric+resistance+arteries+in+type+2+diabetic+db/db+mice+undergo+outward+remodeling.">Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling.</a> PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).</li><li>Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+of+coronary+arteries+in+36+species+of+mammalian+from+mouse+to+giraffe.">Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe.</a> Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).</li></ol>

इस अध्ययन का उद्देश्य murine दिल से चिकनी कोरोनरी संवहनी की पैदावार बढ़ाने के लिए मौजूदा सेल अलगाव प्रोटोकॉल अनुकूल करने के लिए किया गया था। संवहनी चिकनी मांसपेशियों जीव विज्ञान में अग्रणी काम के अधिकां?...

इस पद्धति का लक्ष्य सेल संस्कृति और मानक सेल संस्कृति assays में उपयोग के लिए murine कोरोनरी परिसंचरण से संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) को अलग-थलग करने के लिए है। हम मधुमेह में संवहनी remodeling के आणविक तंत्र का आकलन करने के लिए इस तकनीक को विकसित किया है। हम पहले से मधुमेह 1 की डीबी / DB माउस मॉडल में सेप्टल कोरोनरी धमनियों में hypertrophic remodeling आवक की सूचना है। Murine सेप्टल coronaries में पाया ऊतक की सीमित मात्रा के कारण, मानक प्रयोगात्मक डीबी / DB और नियंत्रण चूहों में प्रोटीन परिवर्तन (जैसे पश्चिमी धब्बा) की जांच की तकनीक पर सबसे अच्छा मुश्किल हो जाता है। इसके अलावा, हम पहले से पता चला है कि एंजियोटेनसिन रिसेप्टर अवरोधक (एआरबी) losartan remodeling डीबी / DB चूहों 2 में मनाया को कम कर देता है। इसलिए, कोरोनरी परिसंचरण से प्राथमिक VSMCs के अलगाव हमें आगे मधुमेह चूहों में VSMC phenotype में परिवर्तन या संकेत सक्रिय रास्ते, योगदान हो सकता है जो जांच करने के लिए अनुमति देता हैटिंग प्रतिकूल कोरोनरी धमनियों जैसे remodeling के लिए। कई अध्ययनों से नहीं बल्कि प्रत्येक विशिष्ट संवहनी बिस्तर में से कृंतक महाधमनी, से अलग VSMCs का उपयोग कर विहित संकेत दे रास्ते elucidated है। हालांकि, हम नाड़ी-बिस्तर कोरोनरी, महाधमनी में विशिष्ट remodeling, और डीबी / DB चूहों 1 की mesenteric परिसंचरण का प्रदर्शन किया है, प्रत्येक नाड़ी बिस्तर में VSMCs सुझाव अलग हो सकता है। इसलिए, यह क्रम में बेहतर VSMCs के प्रत्येक सेट में होने वाली रोग परिवर्तन को समझने के लिए प्रत्येक नाड़ी बिस्तर से VSMCs को अलग करने के लिए आवश्यक है। अलग-थलग करने और महाधमनी VSMCs संवर्धन के लिए विभिन्न तरीकों के ढेर सारे हैं। हालांकि, वर्तमान में, वहाँ केवल एक अध्ययन है कि माउस कोरोनरी परिसंचरण 3 से VSMCs के अलगाव पर प्रकाशित किया गया है। टेंग एट अल। पहले माउस कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs अलग-थलग करने के लिए एक विधि रिपोर्ट करने के लिए किया गया था; हालांकि, हम काफी प्रोटोकॉल में संशोधन किया है वे भी endothelial सेल पृथक रूपरास। अन्य प्रयोगशालाओं भी टेंग एट अल से प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। कोरोनरी धमनी myocytes और airway चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं 4,5 अलग करने के लिए। परिवर्तन हम शामिल किया है कोशिकाओं को अत्यधिक कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs के लिए समृद्ध की आबादी निकलेगा। पृथक स्तनधारी दिल, या Langendorff तकनीक का प्रतिगामी छिड़काव, ऑस्कर Langendorff द्वारा 1897 6 में स्थापित किया गया था और अभी भी व्यापक रूप से हृदय की कोशिकाओं के अलगाव के लिए आज प्रयोग किया जाता है। यहाँ प्रस्तुत तकनीक, आधुनिक murine आनुवंशिक संशोधन की उन्नति के साथ मिलकर, कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs की आणविक व्यवहार के करीब जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">HEPES 1M solution</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">MT-25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primocin - 20mL</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM NEAA 10 mM 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glut 200 mM - Gibco</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-516-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type-2&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor 25mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14170-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">11 plus pump</td>
			<td style="width:143px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">70-2208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Circulating heated water pump</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any brand will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

जबकि अलगाव और बड़े जहाजों से संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) की संस्कृति में अच्छी तरह से स्थापित है, हम कोरोनरी परिसंचरण से अलग और संस्कृति VSMCs करने की मांग की। बरकरार महाधमनी मेहराब के साथ दिल हटा दिया है और पाचन समाधान collagenase प्रकार द्वितीय, 0.1 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन trypsin अवरोध और 1 एम 2 CaCl की 300 इकाइयों / एमएल युक्त के साथ प्रतिगामी Langendorff के माध्यम से भरकर रखा गया था। perfusates 90 मिनट के लिए 15 मिनट के अंतराल, centrifugation द्वारा pelleted पर एकत्र किए गए थे, चढ़ाना मीडिया में resuspended, और टिशू कल्चर व्यंजन पर चढ़ाया। VSMCs SM22α की उपस्थिति, α-SMA, और vimentin की विशेषता थे। इस तकनीक का उपयोग करने का मुख्य लाभ में से एक चूहों के कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs को अलग-थलग करने की क्षमता है। जो आवेदन के लिए कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है कुछ सीमित कर सकते हैं प्राप्त कोशिकाओं की संख्या में छोटे, पृथक कोरोनरी VSMCs अच्छी तरह से स्थापित सेल संस्कृति तकनीक और Assa की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता हैवाई एस। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से VSMCs की जांच के अध्ययन संरचना समारोह और संकेत संवहनी विकृतियों के साथ जुड़े प्रक्रियाओं के बारे में और अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

हमारे कोरोनरी VSMC अलगाव तकनीक के उपन्यास पहलू के कारण, हम सेल अलगाव की शुद्धता निर्धारित करने की मांग की। माउस कोरोनरी VSMCs पारित होने 2. पहली बार धोने के बाद संस्कृति में कोशिकाओं की आकृति विज्...

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Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के अलगाव और संस्कृति कोरोनरी परिसंचरण से murine प्राथमिक संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की तकनीक (VSMCs) का प्रदर्शन है। एक बार जब VSMCs पृथक किया गया है, वे कई मानक संस्कृति तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Murine कोरोनरी संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का अलगाव

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

फोकल Ca 2 + चिकनी पेशी में क्षणिक जांच

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

मानव नाल धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के अलगाव (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

वयस्क और भ्रूण के कंकाल की मांसपेशी Microexplant संस्कृति और कंकाल की मांसपेशी स्टेम सेल के अलगाव

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

अलगाव और भेदभाव Stromal संवहनी कोशिकाओं की Beige / Brite कोशिकाओं को

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

स्नायु उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति, और ट्रांसप्लांटेशन

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

नवजात चूहे से पल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के अलगाव

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Murine वाल्व endothelial कोशिकाओं का अलगाव

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

अलगाव और माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

संवर्धित चिकनी मांसपेशियों का उपयोग कोशिकाओं की sarcoplasmic जालिका के भीतर कैल्शियम उतार चढ़ाव का मापन झल्लाहट आधारित Confocal इमेजिंग

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

माउस कोरोनरी endothelial कोशिकाओं के अलगाव

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...