Name: isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells
Uploaded: 2016-05-30T13:00:00
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이 작품은 (PAL 및 K99HL116769 AJT에하는 R01HL056046) 국립 보건원에서 지원하고, 전국 어린이 병원에서 연구소 (PAL 및 AJT에)했다.

윤리 진술 : 본 연구는 건강 지침의 국립 연구소에 따라 실시하고,이를 전국 어린이 병원에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 1. 준비 / 설정 주 :이 분리 기술은 링 스탠드에 나란히 위치하는 두 랑겐 돌프 가열 코일을 필요로하고, 순환 수조에 병렬로 연결된다. <ol><li> 물 목욕을 순환 켜고 랑겐 돌프 정맥의 끝에서 33 ~ 34 ° C의 최종 온도를 달성하기 위해 온도를 조...

<ol>
	<li>Katz, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arterioles+in+type+2+diabetic+(db/db)+mice+undergo+a+distinct+pattern+of+remodeling+associated+with+decreased+vessel+stiffness.">Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness.</a> Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).</li><li>Husarek, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiotensin+receptor+blocker+losartan+reduces+coronary+arteriole+remodeling+in+type+2+diabetic+mice.">The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice.</a> Vascul Pharmacol. , (2015).</li><li>Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coronary+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+A1+adenosine+receptor-knockout+mice.">Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).</li><li>Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+attenuates+contraction+of+primary+cultured+rat+airway+smooth+muscle+cells.">Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+two-phase+Ca2++release+and+apoptosis+controlled+by+TRP-ML1+channel+activity+in+coronary+arterial+myocytes.">Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).</li><li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation+in+development+and+disease.">Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease.</a> Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).</li><li>Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SM22+alpha,+a+marker+of+adult+smooth+muscle,+is+expressed+in+multiple+myogenic+lineages+during+embryogenesis.">SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis.</a> Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).</li><li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro:+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts.">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li><li>Fisher, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+phenotypic+diversity+and+function.">Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function.</a> Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+phenotype+and+function+of+vascular+smooth+muscle+cells.">Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells.</a> J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).</li><li>Souza-Smith, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenteric+resistance+arteries+in+type+2+diabetic+db/db+mice+undergo+outward+remodeling.">Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling.</a> PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).</li><li>Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+of+coronary+arteries+in+36+species+of+mammalian+from+mouse+to+giraffe.">Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe.</a> Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).</li></ol>

이 연구의 목적은 쥐 하트 매끄러운 관상 혈관의 수율을 높이기 위해 기존의 셀 분리 프로토콜을 적용 하였다. 혈관 평활근 생물학에서 선구적인 작업의 대부분은 배양 된 쥐의 대동맥 평활근 세포로 하였다. 이 연구는 혈관 평활근 세포의 성장, 마이그레이션 및 비대 (7)을 제어하는 분자 메커니즘의 기초 지식을 제공했다. 필드가 진행하지만, 그것은 VSMC 표현형 및 기능 혈관계 특정 요인...

이 방법의 목적은 세포 배양 및 표준 세포 배양 분석에 사용하기 위해 뮤린 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)를 분리한다. 우리는 당뇨병에서 혈관 재 형성의 분자 메커니즘을 평가하기 위해이 기술을 개발했다. 우리는 이전에 당뇨병 (1)의 모델 db / db 마우스에서의 관상 동맥에 중격 비대 리모델링 내측보고 하였다. 때문에 쥐의 중격 관상 동맥에있는 조직의 제한된 양, dB / dB 및 제어 마우스에서 단백질의 변화 (예를 들어, 웨스턴 블롯을) 조사 표준 실험 방법은 가장 어렵습니다. 또한, 우리는 이전에 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB)의 로사 르탄이 dB / db 마우스 2에서 관찰 된 리모델링을 감소하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 관상 동맥에서 주요 혈관 평활근 세포의 분리는 우리가 더 contribu 수있다 당뇨병 쥐의 혈관 평활근 세포 표현형의 변화 또는 신호 활성화 경로를 조사 할 수 있습니다이상 관상 동맥 세동맥 리모델링에 팅. 많은 연구가 아니라 각 특정 혈관 침대에서보다 쥐 대동맥에서 고립 된 혈관 평활근 세포를 사용하여 표준 신호 전달 경로를 밝혀왔다. 그러나, 우리는 다를 수 있습니다 각 혈관 침대에서 혈관 평활근 세포를 제안, 혈관 침대에게 관상 동맥, 대동맥의 특정 리모델링 및 dB / db 마우스 (1)의 장간막 순환을 증명하고있다. 따라서, 더 혈관 평활근 세포의 각 세트에서 일어나는 병리학 적 변화를 이해하기 위하여 각 혈관계의 혈관 평활근 세포를 분리 할 필요가있다. 분리 및 대동맥 혈관 평활근 세포를 배양하기위한 다른 방법의 과다가 있습니다. 그러나, 현재, 마우스 관상 동맥 3에서 혈관 평활근 세포의 분리에 게시 된 하나의 연구가있다. 탱 등은. 마우스 관상 동맥의 혈관 평활근 세포를 분리하는 방법을보고하는 첫번째이었다; 그러나 상당히 프로토콜을 수정 한 또한 내피 CEL 절연로서LS. 다른 연구소는 탱 등의 등의 프로토콜을 사용하고 있습니다. 관상 동맥 근육 세포와기도 평활근 세포 4,5를 분리 할 수 있습니다. 우리가 통합 한 변경은 높은 관상 동맥의 혈관 평활근 세포에 대한 풍부한 세포의 인구를 얻을 것입니다. 분리 된 포유 동물의 심장, 또는 랑겐 돌프 기술의 역 행성 관류는 오스카 랑겐 돌프에 의해 1897 6 년에 설립되었으며, 여전히 널리 심장 혈관 세포의 분리를 위해 오늘 사용된다. 현대 쥐의 유전자 변형의 발전과 함께 여기에 제시된 기술은, 관상 순환에서 혈관 평활근 세포의 분자 행동 가까이 조사를위한 유용한 도구를 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">HEPES 1M solution</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">MT-25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primocin - 20mL</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM NEAA 10 mM 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glut 200 mM - Gibco</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-516-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type-2&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor 25mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14170-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">11 plus pump</td>
			<td style="width:143px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">70-2208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Circulating heated water pump</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any brand will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

격리와 큰 혈관에서 혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)의 문화가 잘 확립하는 동안, 우리는 관상 동맥에서 분리하고 배양 혈관 평활근 세포 노력했다. 완전한 대동맥 아치 하트 제거 소화 용액 콜라겐 타입 II, 0.1 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제 및 1 M CaCl2를 300 단위 / ㎖를 함유하는 역행 랑겐 돌프 통해 관류 하였다. 관류 도금 배지에서 재현 탁하고 원심 분리하여 펠렛을 90 분 동안 15 분 간격으로 수집하고, 조직 배양 접시에서 배양 하였다. 혈관 평활근 세포는 SM22α의 존재, α-SMA 및 vimentin에 의해 특징했다. 이 기술을 사용하는 중요한 장점 중 하나는 마우스의 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포를 분리 할 수​​있는 능력이다. 세포가 이용 될 수있는 애플리케이션들을 제한 할 수 얻어지는 세포의 소수 절연 관상 혈관 평활근 세포는 잘 확립 세포 배양 기술과 ASSA 다양한 사용할 수 있지만YS. 유전자 변형 생쥐에서 혈관 평활근 세포를 조사 연구는 구조 - 기능 및 혈관 병변과 관련된 신호 전달 과정에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다.

우리 인해 관상 혈관 평활근 세포 분리 방법의 신규 한 양상으로, 우리는 세포 분리의 순도를 결정하기 위해 노력했다. 마우스 관상 혈관 평활근 세포는 먼저 세척 후 배양 세포의 형태에 기초하여 통로 (2)에 그 형태 및 면역 형광 염색해서 기초하여 식별하고, 상기 분리 과정은 효과적으로 심장 근육 세포 및 내피 세포를 제거한다. 혈관 평활근 세포는 통로 (2) (그림...

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Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

이 프로토콜의 목적은 관상 동맥에서 뮤린 주 혈관 평활근 세포의 분리 및 배양 방법 (혈관 평활근 세포)을 보여주는 것이다. 혈관 평활근 세포가 분리되고 나면, 이들은 많은 표준 배양 기술에 사용될 수있다.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

초점 칼슘 2 +</sup평활근에서> 과도 감지

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

연구

생물학

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

인간의 탯줄 아티 평활근 세포 절연 (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

신생아 쥐의 폐 동맥 평활근 세포의 분리

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

마우스 관상 내피 세포의 분리

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...